등록번호

안내서-0787-02

화장품 피부감작성 동물대체시험법

(ARE-Nrf2 루시퍼라아제 LuSens 시험법) 가이드라인

(민원인 안내서)

2019.  6.

독성평가연구부  특수독성과

지침서ㆍ안내서 제ㆍ개정 점검표
명칭	화장품 피부감작성 동물대체시험법 (ARE-Nrf2 루시퍼라아제 LuSens 시험법) 가이드라인(민원인 안내서)
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상기 사항에 대하여 확인하였음.
2019년 6월 26일
			담당자 확 인(부서장)		방 서 영 윤 혜 성

이 안내서는 화장품 피부감작성 동물대체시험법(ARE-Nrf2 루시퍼라아제 LuSens 시험법) 가이드라인에 대하여 알기 쉽게 설명하거나 식품의약품안전처의 입장을 기술한 것입니다.

본 안내서는 대외적으로 법적 효력을 가지는 것이 아니므로 본문의 기술방식(‘∼하여야 한다’ 등)에도 불구하고 민원인 여러분께서 반드시 준수하셔야 하는 사항이 아님을 알려드립니다. 또한, 본 안내서는 2019년 2월 현재의 과학적ㆍ기술적 사실 및 유효한 법규를 토대로 작성되었으므로 이후 최신 개정 법규 내용 및 구체적인 사실관계 등에 따라 달리 적용될 수 있음을 알려드립니다.

※ “민원인 안내서”란 대내외적으로 법령 또는 고시ㆍ훈령ㆍ예규 등을 알기 쉽게 풀어서 설명하거나 특정한 사안에 대하여 식품의약품안전처의 입장을 기술하는 것(식품의약품안전처 지침서등의 관리에 관한 규정 제2조)

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제·개정 이력

연번	제·개정번호	승인일자	주요내용
1		2019.6.	화장품 피부감작성 동물대체시험법 가이드라인(민원인 안내서) 제정

Ⅰ. 개요	6

Ⅱ. 시험원리	7

Ⅲ. 제한점 및 고려사항	7

Ⅳ. 시험방법	8

Ⅴ. 인정요건	13

Ⅵ. 시험결과 및 보고	14

- 별첨 1 : 번역본 (OECD TG 442D 서론)
- 별첨 2 : 번역본 (OECD TG 442D 부속서1B)

- 별첨 3 : 원문 (OECD TG 442D Introduction, Appendix 1B)

목  차

화장품 피부감작성 동물대체시험법

(ARE-Nrf2 루시퍼라아제 LuSens) 가이드라인

Ⅰ. 개요

본 시험법은 UN GHS 기준에 따른 피부감작물질과 비감작물질을 구별하는데 사용되는 시험법(ARE-Nrf2 루시퍼라아제 LuSens 시험법)으로 피부감작성 독성발현경로(Adverse Outcome Pathway, AOP)의 두 번째 핵심 단계(Key Event)인 각질세포의 활성화에 대한 생체외 시험에 해당된다.

본 시험법은 랫드 NQO1(NADPH: quinone oxidoreductase) 유전자의 항산화 반응요소(Antioxidant Response Element, ARE)에 의해 전사(transcription) 조절을 받는 루시퍼라아제(Luciferase) 유전자를 안정적으로 삽입한 인체 각질세포주를 사용한다. 피부감작물질에 노출된 세포에서 내인성(endogenous) Nrf2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2) 전사인자(transcription factor)가 횔성화되면 ARE와 결합된 프로모터가 루시퍼라아제 유전자 전사를 유도한다. 이 때, 루시퍼라아제 유전자의 발현 수준은 발광측정기(luminometer)를 통해 측정한다. ARE-Nrf2 의존성 유전자 발현의 변화는 각질세포의 활성화를 나타내며, 이를 통해 피부감작물질과 비감작물질을 구별할 수 있다.

하지만, 본 가이드라인에 기술된 시험법만으로는 피부감작물질을 UN GHS　규정에 의한 1A와 1B로 하위분류 할 수 없다. 따라서 본 시험법은 단독시험법(Stand-alone)으로 사용하기보다 독성발현경로의 핵심 단계(key event)를 다루는 다른 시험법과 조합하여 피부감작 통합독성평가(Integrated Approach to Testing and Assessment, IATA)의 맥락에서 이용될 수 있다.

본 시험법을 본격적으로 수행하기 전에 가이드라인(별첨 2의 부속서 1B-부록)에서 제시된 10개의 숙련도 물질을 사용하여 기술 숙련도를 입증해야 하고, 가이드라인에서 제시하고 있는 인정요건(별첨2의 부속서 1B 인정요건 참조)을 모두 충족하는지를 확인해야 한다.

시험법은 크게 두 단계로 나누어진다. 첫 번째 단계는 세포독성 용량을 설정하는 단계이고, 두 번째 단계는 루시퍼라아제 발현을 평가하는 단계이다. 시험결과는 ① Imax(특정 시험물질 농도에서 용매대조군과 비교하여 증가한 루시퍼라아제 활성 유도의 최대치), ② CV75(세포생존율이 75%로 감소되는 농도)이다.

LuSens 시험에서, ⅰ) 두 번 독립적인 반복실험을 통해 두 번 모두 또는 ⅱ) 세 번 반복실험에서는 두 번에 걸쳐, 다음 조건이 모두 충족되는 경우, 양성으로 판정하고, 그렇지 않은 경우는 음성으로 판정한다. 결과판정 시, 세포독성(즉, 세포 생존율이 70% 이상)이 없는 두 개의 연속적인 시험농도(consecutive non-cytotoxic tested concentrations)에서, 용매대조군과 비교했을 때, 통계적으로 유의하게 루시퍼라아제 유도가 1.5 배 이상이어야 한다. 또한 적어도 세 개의 시험 농도에서는 세포 독성이 없어야 한다(세포 생존율은 70% 이상).

Ⅱ. 시험원리

피부감작물질과 같은 저분자 전자친화성 물질(small electrophilic substances)은 감지 단백질(sensor protein)인 Keap1(Kelch-like ECH -associated protein 1)에 작용하여 전사인자(transcription factor)인 Nrf2를 해리시킨다. 해리된 Nrf2는 phase II 해독효소를 코딩하는 유전자와 같은 ARE 의존성 유전자를 활성화시킨다. 본 시험법은 ARE와 결합된 프로모터의 전사 조절을 받는 루시퍼라아제 유전자를 안정적으로 도입한 세포주를 사용한다. 세포주에 시험물질을 처리한 후 발광하는 루시퍼라아제 기질(substrate)을 이용하여 루시퍼라아제 유전자 발현 유도의 정량적 측정이 가능하다.

Ⅲ. 제한점 및 고려사항

본 시험법은 UN GHS 규정에 의한 1A, 1B 하위 분류 할 수 없다. 각질세포의 Keap1-Nrf2-ARE 경로 활성화는 피부감작성 독성발현경로의 여러 핵심 단계 중 하나의 단계이기 때문에 화학물질의 피부감작 가능성 여부를 결론 내리기에 충분치 않을 수 있다. 따라서 통합독성평가(IATA)의 안에서 사용하도록 하며, 이 경우 감작능(Sensitization potency)을 평가하는 데에도 기여할 수도 있다.

현재 이용 가능한 데이터에 따르면 LuSens 시험법은 다양한 유기 작용기, 반응기전, 피부감작능(생체외 시험에서 확인한 바와 같이), 물리화학적 성질을 가지는 시험물질에 적용할 수 있다. 본 시험법은 가용성이거나 시험물질처리 배지(exposure medium)에서 안정하게 현탁(즉, 시험물질이 용매로부터 침전되거나 층이 분리되지 않는 콜로이드 또는 현탁액)되는 시험물질에 적용된다. 최종 최고 시험 농도 (즉, 시험물질 2000 μM 또는 분자량이 명확하지 않은 경우 2000 µg/mL)에서 위의 조건을 충족시키지 못한 시험물질은 더 낮은 농도에서 시험할 수 있다.  그러한 경우, 양성 기준을 충족하는 결과는  피부감작물질을 확인하는데 이용될 수 있지만, 균질하게 현탁되지 않아 2000 μM(또는 분자량이 명확하지 않은 경우 2000 µg/mL)까지 시험하지 못하고, 최대 농도에서 세포독성이 나타나지 않는 경우 음성결과가 나온 경우라도 미결로 간주한다.

라이신-잔기(lysine-residue)에 대한 반응성을 보이는 물질은 이 시험법에서 위음성으로 나올 수 있기 때문에 음성 결과 해석에 주의해야 한다. 또한, 사용된 세포주의 제한된 대사능력과 실험조건 때문에 특히 산화율이 낮은 프로합텐(pro-haptens, P450 효소를 통해 효소 활성화가 필요한 화학물질)과 프리합텐(pre-hapten, 자기산화에 의해 활성화되는 화학물질)의 경우도 음성 결과를 도출할 수 있다. 반면에 감작물질은 아니지만 화학적 스트레스 인자(stressor)인 시험물질은 위양성 결과를 도출할 수 있다. 루시퍼라아제 효소활성에 간섭하는 시험물질은 세포 기반의 시험에서 루시퍼라아제의 활성을 교란시켜 발광을 확연히 증가시키거나 확연히 감소시킬 수 있어, 고농도의 식물에스트로겐과 같이 루시퍼라아제 리포터 유전자를 과활성시키는 유사한 화합물에 의한 루시퍼라아제 발현 결과는 신중하게 분석되어야 한다.

IV. 시험방법

4.1. 세포배양

ARE에 의해 조절되는 루시퍼라아제 유전자가 안정적으로 삽입된 LuSens 형질전환 세포주(transgenic cell line)를 사용한다. 세포주를 수령하면 1-3 계대(passage) 증식시키고 균질한 조건으로 세포(stock)를 냉동 저장하며, 수령한 세포의 계대 수로부터 계대 수는 최대 20 계대 수까지 가능하다(수령 후, 첫 계대 수는 0으로 하며, 세포독성 용량설정시험은 20 계대, 루시퍼라아제 시험은 15 계대까지 사용할 수 있다). 혈청과 항생제이 포함된 세포배양배지(DMEM)를 사용하며, 시험 중에는 배지에 항생제를 넣지 않는다. 세포 포화도(confluent)가 80–90%정도 되면 시험 전날 96-well 플레이트에 1X104 cell/well로 분주한다. 각 시험물질 농도에 대해 3개의 반복시료(replicate)를 사용하여 각각 루시퍼라아제 활성와 세포 생존율을 분석한다.

4.2. 시험물질 및 대조물질 조제

시험물질은 DMSO(dimethyl sulfoxide, CAS No. 67-68-5, ≥99% 순도)와 같은 적절한 용매에 최종 최대농도(200 mM)로 녹인다. 시험물질이 DMSO에 용해되지 않는 경우, 멸균수 또는 배양배지를 사용한다. 분자량(MW)이 정해지지 않은 시험물질의 경우 원액(stock solution)을 200 ㎎/mL 또는 20% (w/v) 농도로 준비한다.

DMSO로 용해시킨 시험물질 원액을 DMSO로 연속 희석(희석배수 2)하여 초기 희석단계(master) 용액(0.098부터 200 mM 범위의 12개 농도)을 만든다. 사용한 용매와 상관없이 초기 희석단계(master) 용액은 혈청을 함유한 배양배지로 25배(1차 희석)하고, 4배(2차 희석)로 희석하여 사용한다. 시험물질의 최종 농도는 0.98부터 2000 μM이다.

루시퍼라아제 활성을 측정하기 전에 세포독성 용량설정(cytotoxicity pre-range dose finding test) 시험을 수행한다. 위의 농도에서 세포생존율이 75%로 감소되는 농도(CV75)를 결정한다. CV75는 시험할 농도를 결정하는 기준으로 사용된다(CV75보다 높은 농도, CV75 및 CV75보다 낮은 4가지 농도(CV75/2.07, CV75/1.73, CV75/1.44, CV75/1.2, CV75 및 CV75x1.2 μM)는 연속 희석 배수 1.2를 사용하여 희석).

세포독성 용량설정 시험에서 용매/부형제 대조군(DMSO)은 플레이트당 12개의 well을 준비한다(그림1-회색 참조). 초기 희석단계(master) 용액과 동일한 희석과정을 거쳐서 용매/부형제 대조군의 최종 농도는 1%가 된다. 음성대조군(DL-Lactic acid(CAS No. 50-21-5, ≥99% 순도))은 5000 μM(또는 450 µg/mL)이며, 플레이트당 3개의 well씩 준비한다(그림1-파란색 참조). 또한, 아무것도 처리하지 않은 배지대조군(세포와 배양배지로 구성된 blank)을 플레이트당 6개의 well씩 준비한다(그림1-초록색 참조). 양성대조군은 120 μM의 Ethylene Glycol Dimethacrylate(EGDMA, CAS No. 97-90-5, ≥99% 순도)으로 플레이트당 2개의 well씩 준비하고(그림1-빨간색 참조), 초기 희석단계(master) 용액과 동일한 희석단계를 거친다. 120 μM의 EGDMA에서 독성이 너무 높거나 루시퍼라아제를 2.5배 이상 유도하지 않는 경우, EGDMA 범위 설정 시험을 수행할 수 있다(루시퍼라아제가 용매/부형제 대조군에 비해 2.5배 이상 유도되고 세포생존율이 70% 이상인 농도를 설정).

그림 1. 세포독성 용량설정 시험 플레이트 배치도

루시퍼라아제 시험에서 용매/부형제 대조군은 DMSO로 플레이트당 24개의 well을 준비한다(그림2-회색 참조). 음성대조군은 5000 μM(또는 450 µg/mL)의 DL-Lactic acid(CAS No. 50-21-5, ≥99% 순도)이며, 플레이트당 6개의 well씩 준비한다(그림2-파란색 참조). 배지대조군은 플레이트당 12개의 well씩 준비한다(그림2-초록색 참조). 양성대조군은 120 μM의 Ethylene Glycol Dimethacrylate(EGDMA, CAS No. 97-90-5, ≥99% 순도)으로 플레이트당 5개의 well씩 준비한다(그림2-빨간색 참조).

그림 2. 루시퍼라아제 시험 플레이트 배치도

4.3. 시험물질 및 대조물질 적용

각 시험물질과 양성대조물질에 대해 각각 3개의 반복시료를 포함하여, 최소한 두 번의 독립적인 반복실험(repetitions)이 필요하다(n=6). 두 번의 독립적인 반복실험의 결과가 불일치한 경우, 세 번째 반복실험을 실시해야 한다(n=9).

세포를 96-well 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 분주하여 24시간 배양한다. 이어, 새로운 시험용배지(혈청을 포함하고 항생제를 제외한 DMEM 150 μL)로 교환하고, 50 μL의 25배 희석된 시험물질 또는 대조물질을 첨가한다. 발광도 배경값(background values) 측정을 위해 플레이트당 최소 1개의 well은 비워둔다(물질을 처리하지 않은 세포). 시험물질을 처리한 플레이트는 37±1℃, 5% CO2 조건에서 48시간 배양한다. 시험물질을 처리하는 동안, 호일(foil)로 플레이트를 덮어 휘발성 시험물질의 증발과 well 간 교차오염이 일어나지 않도록 주의한다.

4.4. 루시퍼라아제 활성 측정

세포를 시험물질 및 대조물질에 48시간 동안 처리한 후, 인산완충 생리식염수(PBS)로 세척하고, 발광도 측정을 위하여 적절한 용해 완충액(lysis buffer)을 각 well에 넣고 5-10분 동안 차광상태에서 반응시킨다. 세포 용해물(lysate)이 들어 있는 플레이트를 발광측정기에 두고, 프로토콜에 명시된 프로그램(DB-ALM 프로토콜 184번 참조)을 사용하여 판독한다.

4.5. 세포독성 측정

세포생존율(cell viability, CV) 분석을 위해 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5- diphenyltetrazolium bromide, Thiazolyl blue tetrazolium bromide; CAS No. 298-93-1)를 함유한 새로운 배지로 교환하고, 37±1℃, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 배양한다. MTT 배지를 제거하고 DMSO 용액(10% SDS 및 0.4% acetic acid 포함)을 첨가하여 5분 동안 용해한 후, 600 nm에서 흡광도를 측정한다.

4.6. 데이터 평가

LuSens 시험법에서는 다음의 매개변수를 계산한다.

시험물질의 각 농도(CV75/2.07, CV75/1.73, CV75/1.44, CV75/1.2, CV75 및 CV75x1.2 μM), 양성대조군 및 음성대조군에서 루시퍼라아제 활성 유도 배수(Fold luciferase activity induction, Imax)

시험에 사용된 모든 물질과 대조군 농도에서의 세포생존율(CV)

세포생존율 75%가 되는 농도(CV75)

Imax는 수식 1, CV는 수식 2, CV75는 수식 3에 따라 계산한다.

수식 1:	Fold induction =	(Lsamplet-Lblank)
		(Lsolvent-Lblank)

Lsample  :	시험물질 well에서의 발광도 측정 값

Lblank   :	세포도 없고 어떤 처리도 하지 않은 발광도 측정값

Lsolvent  :	세포와 용매대조군을 포함하는 well에서 평균 발광도 측정값

수식 2:	Viability =	(Vsamplet-Vblank)	x100
		(Vsolvent-Vblank)

Vsample  :	시험물질 well에서 MTT- 흡광도 값

Vblank   :	세포도 없고 어떤 처리도 하지 않은 빈 well의 MTT- 흡광도 값

Vsolvent  :	세포와 용매대조군을 포함하는 well에서 평균 MTT- 흡광도 값

수식 3:	CV75 =	(Cb – Ca) ×	(75-Vb)	+Cb
			(Vb-Va)

Ca  :    세포생존율이 75% 이상인 최저 시험 농도(µM)

Cb  :    세포생존율이 75% 이하인 최고 시험 농도(µM)

Va  :    Ca로 얻은 % 생존율

Vb  :    Cb로 얻은 % 생존율

4.7. 결과의 해석 및 예측 모델

두 번의 반복실험에서 두 번 모두 또는 세 번의 반복실험 중 두 번이 아래 조건을 모두 만족한다면 그 결과는 양성으로 판정하고, 그렇지 않으면 음성으로 판정한다. (그림 3.)

1. 적어도 두 개의 연속적인 세포독성이 없는 농도(CV≥70%)에서 용매대조군에 비해 루시퍼라아제 유도는 1.5배 이상이며 통계적으로 유의해야 한다.

2. 적어도 세 개의 시험농도는 세포독성이 없어야 한다(CV≥70%).

또한, 안정하게 현탁되지 않고 2000 μM (또는 분자량이 명확하지 않은 경우 2000 µg/mL)까지 시험하지 않았으며, 시험된 어떠한 농도에서도 세포 독성이 관찰되지 않는 경우, 음성 결과는 미결로 간주한다.

그림 3 LuSens 시험법에 예측을 도출하는 기준의 개요

V. 인정요건

LuSens 시험법은 다음의 인정요건을 충족해야 한다.

1) 양성대조군 120 μM EGDMA의 평균 루시퍼라아제 활성 유도는 용매/부형제 대조군과 비교하여 2.5배 이상이어야 하고, 세포생존율이 70% 이상이어야 한다.

2) 음성대조군 5000 μM DL-Lactic acid의 평균 루시퍼라아제 활성 유도와 미처리 세포의 기저(basal) 발현은 용매/부형제 대조군 평균과 비교하여 1.5배 미만이어야 한다.

3) 용매/부형제 대조군(DMSO)의 발광도 측정 값 평균 변동계수(SD)는 20% 미만이어야 한다.

4) 최소한 3개의 시험 농도는 용매/부형제 대조군에 비해 세포생존율이 70% 이상이어야 한다. 또한, 결과가 음성으로 간주될 경우, 적어도 하나의 농도가 세포독성이 있어야 한다. 예를 들면, 세포생존율 ＜70% 또는 최대 농도 2000 μM(또는 분자량이 명확하지 않은 경우 2000 µg/mL)에서 시험되어야 한다.

5) 1)~4) 중 하나라도 충족시키지 못하면, 시험을 다시 실시해야 한다.

VI. 시험결과 및 보고

시험보고서는 다음의 사항을 포함한다.

시험물질

• 단일성분물질

o IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호, SMILES 또는 InChI 코드, 구조식 및/또는 배치/lot 번호 및 유효기간과 같은 기타 식별자료 등의 화학물질 식별 정보

o 물리적 성상, 용해도, DMSO 용해도, 분자량 및 기타 관련 물리화학적 특성(확보 가능한 범위에서)

o 시험물질처리 배지(exposure medium)에서의 용해도 또는 분산 안정성에 대한 설명

o 순도, 불순물의 화학물질 식별정보

o 해당하는 경우, 시험 전 처리방법(예, 가온, 분쇄)

o 시험 농도

o 확보 가능한 범위에서 보관 조건 및 안정성.

• 다성분물질, UVCB 및 혼합물

o 가급적 많은 물질의 특성 정보(예: 화학물질 식별정보(위 참조), 확보 가능한 범위에서 순도, 함유량 및 해당 성분의 관련 물리 화학적 성질(위 참조))

o 물리적 성상, 용해도, DMSO 용해도 및 기타 관련 물리화학적 특성(확보 가능한 범위에서)

o 시험물질처리 배지(exposure medium)에서 용해도 또는 분산 안정성에 대한 기술

o 분자량 또는 조성이 알려진 혼합물/중합체의 경우 겉보기 분자량(apparent molecular weight) 또는 시험 수행 관련된 기타 정보

o 해당하는 경우, 시험 전 처리방법(예, 가온, 분쇄)

o 시험 농도

o 확보 가능한 범위에서 보관 조건 및 안정성.

*UVCB(Unknown or Variable composition, Complex reaction products or Biological materials)

대조군

• 양성대조군

o IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호, SMILES 또는 InChI 코드, 구조식 및/또는 다른 식별자료 등의 화학물질 식별 정보

o 물리적 성상, 용해도, DMSO 용해도, 분자량 및 기타 관련 물리화학적 특성(확보 및 적용 가능한 범위에서)

o 순도, 불순물의 화학물질 식별정보

o 해당하는 경우 시험 전 처리(예: 가온, 분쇄)

o 시험 농도

o 확보 가능한 범위에서 보관 조건 및 안정성

o 해당하는 경우, 적합한 인정요건을 입증할 수 있는 기존 양성대조군 결과에 대한 참고자료

• 용매/부형제 대조군

o IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호 및/또는 다른 식별자료 등의 화학물질 식별 정보

o 순도, 불순물의 화학물질 식별정보

o 본 가이드라인에서 언급된 것과 다른 용매/부형제가 사용된 경우, 물리적 성상, 분자량 및 기타 관련 물리화학적 성질

o 확보 가능한 범위에서 보관 조건 및 안정성

o 각 시험 화학 물질의 용매/부형제 선택에 대한 근거 제시

• 음성 대조군

o IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호 및/또는 다른 식별자료 등의 화학물질 식별 정보

o 순도, 불순물의 화학물질 식별정보

o 본 가이드라인에서 언급된 것과 다른 음성 대조군/부형제가 사용된 경우, 물리적 성상, 분자량 및 기타 관련 물리화학적 성질

o 확보 가능한 범위에서 보관 조건 및 안정성

o 본 가이드라인에서 언급된 것과 다른 음성대조군이 사용된 경우, 음성대조군 선택에 대한 근거 제시

시험 방법 조건

• 시험의뢰자, 시험기관, 시험책임자의 이름과 주소

• 사용된 시험법에 대한 설명

• 사용한 세포주, 세포주 보관 조건과 공급처(예: 세포주 제공 기관)

• 세포주의 계대수, 시험에 사용된 세포 포화도(confluent)

• 시험 전 세포 분주(seeding) 시 사용한 세포수 측정 방법과 균질한 세포수 배분에 대한 방법

• 사용된 발광측정기(예, 모델), 기기 설정, 사용된 루시퍼라아제 기질(substrate), 부속서의 부록 3에서 설명한 대조실험에 근거한 발광도 측정의 적절성 제시

• 시험 수행(예: 숙련도 물질 시험)에서 실험실의 숙련도 입증 또는 지속적인 시험법의 재현성 입증을 위한 절차

시험 절차

• 시험에 적용된 반복실험(repetitions)과 반복측정(replicates)의 횟수

• 시험 물질 농도, 시험 물질 처리 절차, 처리 시간(권장과 다를 경우)

• 사용된 평가 및 결정 기준에 대한 설명.

• 사용된 인정요건에 대한 설명.

• 시험 절차의 모든 변경 사항에 대한 설명

결과

• 개별 반복실험의 시험물질과 양성대조군로부터 얻은 루시퍼라아제 유도 활성 및 생존율 (예: LuSens 시험법에 대한 CV75)의 도표화

• 모든 개별 반복실험 값으로부터 계산된 평균값 (예를 들면, 세포생존율 및 루시퍼라아제 활성 유도의 산술평균) 및 표준편차

• 예측모델에 따른 시험물질의 등급 표시

• 각 시험에 대한 용매/부형제 대조군의 발광도 측정 값에서 도출한 변동계수

• 루시퍼라아제 활성 유도와 생존율에 대한 용량-반응 곡선 그래프

• 해당되는 경우, 다른 관련된 관찰사항에 대한 기술

결과에 대한 고찰

• LuSens 시험법 결과에 대한 고찰

• 기타 관련 정보가 있는 경우, IATA의 측면에서 시험법 결과에 대한 고려사항

별첨 1. 번역본 (OECD TG 442D 서론)

생체외 피부감작성 : ARE-Nrf2 루시퍼라아제 LuSens 시험법

In Vitro Skin Sensitisation: The ARE-Nrf2 Luciferase LuSens Test

핵심단계 기반 각질세포 활성

1.	피부감작성 물질이란 UN의 화학물질의 분류 및 표시에 관한 국제조화시스템 (United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, UN GHS)(1)에 정의된 바와 같이 반복적 피부 접촉 후 알레르기 반응을 유도하는 물질을 일컫는다. 피부감작에 관여하는 주요한 생물학적 기전에 대해서 합의된 견해가 있다. 피부감작과 관련된 화학적/생물학적 기전은 독성발현경로(Adverse Outcome Pathway, AOP)(2)를 통해 설명될 수 있다. 독성발현경로는 분자 수준의 시작 단계에서 중간 단계를 거쳐 알레르기성 접촉성 피부염을 유발하는 건강유해영향 과정으로 이루어진다. 이러한 독성발현경로는 유기화학물질과 같은, 티올(thiol, 시스테인) 및 1차 아민(amine, 라이신)과 반응하는 화학물질에 초점을 맞추고 있다. 이와 관련하여, 분자 수준의 시작 단계(첫 번째 핵심 단계)는 피부 단백질의 친핵성 중심(nucleophilic centres)에 전자친화성 물질(small electrophilic substances)들이 공유 결합을 하는 것이다. 두 번째 핵심 단계는 각질세포에서 염증 반응과 항산화/전자친화성 반응요소-의존성 경로(antioxidant/electrophile response element(ARE)-dependent pathways)와 같은 세포 신호전달 경로 관련 유전자 발현의 변화를 포함한다. 세 번째 핵심 단계는, 일반적으로 특정 세포 표면 표지자(surface markers), 케모카인(chemokines), 싸이토카인(cytokines)의 발현을 확인하는 수지상세포(Dendritic Cells, DC)의 활성이다. 네 번째 핵심 단계는 T-세포 증식이다(3).

2.	본 시험법은 피부 감작성 독성발현경로의 두 번째 핵심 단계인 각질 세포 활성화(2)(keratinocyte activation)에 대한 생체외 시험에 해당된다. 본 시험법은 UN GHS(1)에 따라 피부감작성 물질과 비감작성물질을 구별하는데 사용되는 두 개의 시험법으로 이루어진다.

• ARE-Nrf2 루시퍼라아제 KeratinoSens™ 시험법 (부록 IA)
• ARE-Nrf2 루시퍼라아제 LuSens 시험법 (부록 IB).

3.	이 두 개의 ARE-Nrf2 루시퍼라아제 시험법은 과학적으로 검증되었다. KeratinoSens™ 시험법은 검증 연구를 거쳐 EURL ECVAM 과학 자문위원회(ESAC)의 독립적인 전문평가와 EURL ECVAM의 긍정적인 추천을 받았으며, 검증된 참고 시험법(VRM)으로 승인되었다(3)(4)(5)(6). LuSens 시험법은 유사시험법평가기준(Performance Standards, PS) 기반 검증연구를 거친 후 KeratinoSens™ 와 마찬가지로 ESAC(7)(8)(9)(10)의 전문평가와 긍정적인 의견을 받았다.

4.	본 가이드라인의 시험법은 데이터 생산 과정과 결과 양식은 다를 수 있지만, 각질세포 활성화(피부감작성 독성발현경로의 핵심 단계)의 시험결과는 각 국가의 필요한 부분을 설명하기 위해 구분 없이 사용할 수 있으며, 이는 데이터 상호인정(Mutual Acceptance of Data)의 장점이 있다.

핵심 단계 기반 시험 가이드라인에 포함된 시험법의 배경 및 원칙

5.	피부감작성의 평가는 일반적으로 동물 실험을 수반한다. 기니픽을 사용하는 고전적 방법인 Magnuson과 Kligman의 기니픽 극대화 시험(Guinea Pig Maximisation Test, GPMT)과 Buehler 시험(OECD TG 406)(11)은 피부감작성의 유도기(induction phase) 및 유발기(elicitation phase)를 평가한다. 마우스를 이용한 시험법인 LLNA(OECD TG 429)(12)와 세 개의 비방사능 시험법인 LLNA: DA(OECD TG 442A)(13), BrdU-ELISA 및 BrdU-FCM(OECD TG 442B)(14)은 모두 유도 반응만을 평가한다. 이 시험법 모두는 피부감작성 유도기에 대해 객관적으로 측정하고 동물 복지 측면에 있어 기니픽 시험에 비해 장점을 제공하기 때문에 받아 들여졌다.

6.	피부감작성 독성발현경로의 세 가지 핵심 단계를 다루는 기전에 근거한 화학적(Mechanistically-based in chemico)시험법과 생체외(in vitro) 시험법은 화학 물질의 피부감작성 위험성 평가를 위해 채택되었다: OECD TG 442C는 첫 번째 핵심 단계를 다루는 「펩티드 반응성 시험법」(Direct Peptide Reactivity Assay)(15) 이며, 본 시험법은 두 번째 핵심 단계를 다루는 각질세포 활성화를 평가하는 시험법이고, OECD TG 442E는 세 번째 핵심 단계인 수지상 세포의 활성화를 다루고 있다(16). 마지막으로, T-세포 증식을 나타내는 네 번째 핵심 단계는 마우스를 이용한 국소 림프절 시험법 (Local Lymph Node Assay, LLNA)(12)을 통해 간접적으로 평가된다.

7.	각질세포 활성화는 피부감작성 독성발현경로(2)(17)의 여러 핵심 단계 중 하나의 단계이기 때문에 화학물질의 피부감작 가능성 여부를 결론 내리기에 충분하지 않을 수 있다. 따라서 본 가이드라인에 기술된 시험법의 결과는 다른 보완적인 정보들, 예를 들어 다른 핵심 단계들을 다루는 생체외 시험법과 비시험법(non-testing methods)(유사한 화학물질과의 상관성방식(Read-across)을 포함)으로 얻은 결과들과 조합하여 통합독성평가(Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA)내에서 사용될 때 피부감작성(UN GHS Category 1)과 비감작성을 구별할 수 있다(17). 규정된 접근법(Defined Approach)(정보소스와 예측 절차에 있어 표준화 된 접근법)내에서 이러한 방법에 의해 생성된 결과들의 활용 예가 보고되었으며,(17) 이는 통합독성평가(IATA)내 유용한 요소로 활용될 수 있다.

8.	본 가이드라인에서 기술된 시험법만으로는 피부감작물질을 UN GHS(1) 규정에 의한 1A와 1B로 하위 분류할 수 없으며, 안전성 평가에 필요한 감작능 정도(potency)를 예측하는 용도로 사용할 수 없다. 그러나 규제 체계에 따라, 본 시험법의 양성결과 자체만으로 UN GHS category 1로 분류할 수 있다.

9.	본 가이드라인에서 "시험물질(test chemical)" 용어는 시험대상을 의미하며1), 단일성분물질, 다성분물질 및/또는 혼합물 시험에 대한 시험법의 적용 가능성과는 관련이 없다. 시험 시 시험물질이 시험물질처리 배지(exposure medium)에 용해되거나 적어도 안정한 현탁액(예: 육안으로 볼때, 시험물질처리 배지(exposure medium)에 최대 최종 시험 농도로 용해시 용해/조제된 시험물질의 잔류물이 남아 있지 않고 시험용액을 수 시간 방치하였을 때 침전 또는 층분리가 일어나지 않는 상태)을 형성하는 것을 확인해야 한다.

10.	현재 다성분물질/혼합물(18)(19)(20)에 대한 시험법의 적용 가능성에 대한 정보는 제한적이다. 비록 검증 연구에서 평가되지는 않았지만, 본 시험법은 기술적인 면에서 다성분물질 및 혼합물을 시험하는데 적용될 수 있을 것이다. 한편 혼합물, 시험이 어려운 화학 물질 (예 : 불안정) 또는 본 가이드라인에서 제시된 적용 범위 내에 명확히 해당되지 않는 시험물질로 시험을 수행할 때는, 해당 시험 결과가 과학적으로 의미 있는 결과를 줄 수 있는지 여부를 사전에 검토해야 한다. 또한, 다성분물질 또는 혼합물을 시험할 경우, 시험물질 내 세포독성 성분의 간섭영향 가능성을 고려해야 한다(예: 비감작성 성분의 함량이 높으면, 저농도의 감작성 성분 또는 약한 감작성 성분의 양성반응이 가려질 수도 있음). 특정 경우에 따라, 주요 분획(fraction)을 구성하는 단일 주요 성분이나 여러 분획의 시험을 통해 복합 혼합물(complex mixture)의 감작 정도를 평가하는 것이 과학적으로 타당할 수 있다.

부록 1 - 정의

정확도(Accuracy) : 시험 결과와 허용된 참고치의 일치 정도로, 시험법 성과를 측정하는 기준이자 상관성(relevance)의 요소에 해당됨. 시험결과의 정확도를 의미하는 “일치성(concordance)”과 같은 의미로 혼용되어 사용된다(3).

독성발현경로(AOP, Adverse Outcome Pathway) : 표적 화학물질 또는 유사한 그룹의화학구조로부터 분자 수준의 시작단계를 거쳐 생체외 유해반응을 일으키기까지 일련의 과정(2).

항산화 반응요소(ARE, Antioxidant Response Element) : 전자친화 반응요소(EpRE, electrophile response element)로도 불리며, 세포보호 및 phase II 유전자 상류 프로모터 부위(upstream promoter region)에 있는 반응요소. Nrf2에 의하여 활성화 되면 항산화 반응요소(ARE)는 이들 유전자의 전사 유도를 일으킨다.

CV(Cell viability) : 세포 생존율

변동계수(Coefficient of variation) : 동일시료로부터 얻은 데이터의 변동성을 나타내며 표준편차를 평균으로 나눈 값. 100을 곱하여 백분율로 나타낼 수도 있음

CV75 : 75%의 세포생존율을 나타내는 추정 농도

EC1.5 : 1.5배 루시퍼라아제 활성 유도를 나타내는 추정 농도

Fold luciferase activity induction : 시험물질의 용매/부형제 대조군에 노출된 세포 발광도에 대하여 시험물질을 처리한 세포의 발광도 비율

IC30 : 세포생존율을 30% 감소시키는 농도

IC50 : 세포생존율을 50% 감소시키는 농도

유해성(Hazard) : 생체, 생태계, 특정 집단이 화학물질에 노출되었을 때, 유해한 영향을 일으킬 가능성이 있는 물질 또는 환경의 내재적 특성

통합독성평가(IATA, Integrated Approach to Testing and Assessment) : 화학물질 또는 화학물질 그룹의 위험성 확인(유해 가능 여부), 위험성 결정(효력 정도) 또는 안전성 평가(가능 여부/효력 정도, 노출)에 사용하는 구조적 접근방법. 모든 관련 데이터들을 전략적으로 통합하고 가중치를 부여하여, 잠재적인 유해성(hazard) 또는 위해성(risk) 또는 심화 추적과 최소한의 시험(minimal test) 필요성에 대한 정보 제공.

Imax 값 :  특정 시험물질 농도에서 용매(음성)대조군과 비교하여 루시퍼라아제 활성 유도의 최대치

Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1) : Nrf2 활성을 조절하는 감지 단백질(sensor protein). 활성 유도가 되지 않은 상태에서 Keap1 감지 단백질(sensor protein)은 Nrf2 전사인자에 ubiquitin 표지를 매개하고 proteasome에서 단백분해함. Keap1의 반응성 시스테인 잔기가 저분자 물질에 의해 공유결합 변형되어 Nrf2가 Keap1으로부터 분리됨(4)(5)(6)

혼합물(Mixture) : 서로 반응하지 않는 두 개 이상의 화학물질로 구성된 혼합물 또는 용액(1).

단일성분물질(Mono-constituent substance) :  정량적 구성 정의에 의하면, 하나의 주요성분이 적어도 80% (w/w) 이상인 물질

다성분물질(Multi-constituent substance) :  두 가지 이상의 주요성분의 양이 ≥ 10% (w/w) 및 < 80% (w/w)인 물질. 다성분 물질은 생산과정의 산물이며, 혼합물과 다성분물질의 차이는 혼합물은 두 가지 이상의 물질을 화학반응 없이 섞여서 얻고, 다성분 물질은 화학반응의 산물임

음성대조군(Negative control) : 시험계의 모든 구성 요소를 포함하고 양성반응을 유도하지 않는 것으로 알려진 물질로 처리된 시료. 이 시료는 시험물질 처리 시료 및 기타 대조군 시료와 함께 사용됨.

Nrf2 : nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2는 항산화 반응 경로에 관여하는 전사 인자. Nrf2가 ubiquitin 표지되지 않으면 세포질에 많아지고, 핵으로 이동하여 많은 세포보호 유전자의 상류 프로모터 부위(upstream promoter region)의 ARE에 결합하고 이들 유전자의 전사를 유도함(4)(5)(6).

유사시험법평가기준(Performance standards) : 검증된 시험방법을 기반으로 기전적, 기능적으로 유사한 시험방법의 비교 가능성을 평가하는 기준으로 다음 사항을 포함함.

(1) 필수적 시험 방법 구성요소;

(2) 검증된 시험방법의 허용 가능한 수행 검증을 위해 사용된 화학물질들 중에서 선택된 최소한의 기준 물질 리스트;

(3) 검증된 시험 방법에서 얻은 내용을 기반으로 정확성과 신뢰도의 비교 수준. 이는 제시된 시험 방법이 기준 화학물질의 최소한의 리스트를 이용해 평가했을 때 증명되어야 함(3)

양성대조군(Positive control) : 시험계의 모든 구성요소를 포함하고 양성반응을 유도한다고 알려진 물질로 처리한 군. 시간에 따른 양성대조군 반응의 변동성을 평가할 수 있다는 확신을 갖기 위하여 양성반응의 범위가 초과해서는 안 됨

숙련도 물질(Proficiency chemicals or substances) : 표준화 된 시험 방법으로 기술적인 능력을 입증하기 위해 실험실에서 사용할 수 있는 유사시험법평가기준에 포함된 참고물질. 이 물질의 선택 기준은 일반적으로 반응 범위를 대표한다는 것과 시중에서 구할 수 있는 것, 그리고 고품질의 유용한 시험자료가 있는 것

참고물질(Reference chemicals or substances) : 새로운 시험법이 검증된 참고 시험법으로 증명된 허용 기준 충족 여부를 입증하는 데 사용되는 화학물질 집합. 이 화학물질은 시험법이 사용될 것으로 예상되는 화학물질의 부류를 대표해야 하며 화학물질이 일으킬 것으로 예상되는 반응의 모든 범위(강, 약, 음성)를 나타내야 한다.

상관성(Relevance) : 시험과 관심 효과의 관련성 및 시험이 특정 목적에 의미 있고 유용한 지에 대한 설명. 상관성은 시험이 얼마나 관심 생물학적 효과를 정확하게 측정하고 예측하는지를 나타내며, 상관성은 시험법의 정확도(일치성)를 내포함(3)

신뢰도(Reliability) : 동일한 시험방법에 따라 반복 시행하였을 때 동일 실험실과 다른 실험실에서 시험 결과를 재현할 수 있는 정도. 신뢰도는 실험실 내, 실험실 간 재현성(reproducibility)과 실험실 내 반복성(repeatability)으로 평가됨(3).

재현성(Reproducibility) : 동일한 방법으로 동일한 물질을 시험하였을 때 나온 결과의 일치(신뢰도 참조)(3).

민감도(Sensitivity) : 시험법으로 모든 양성/활성 화학물질이 정확하게 분류되는 비율. 민감도는 시험법의 범주 결정에 대한 시험법 정확도의 척도이며 시험법의 상관성을 평가하는 중요 고려사항(3).

용매/부형제 대조군(Solvent/Vehicle control) : 용매 등 시험계의 모든 구성요소를 포함하지만 시험물질은 처리하지 않는 군. 동일한 용매에 녹인 시험물질로 처리한 시료의 기본반응(baseline response)을 평가하기 위해 사용

특이도(Specificity) : 시험법으로 모든 음성/비활성 화학물질이 정확하게 분류되는 비율. 특이도는 범주 결정에 대한 시험법 정확도의 척도이며 시험법의 상관성을 평가하는 중요 고려사항(3).

물질(Substance) : 생산과정을 통해 얻어지거나 또는 자연상태로 얻어진 화학원소들(elements)과 이들로 이루어진 화합물(compound). 생산품의 안정성을 유지시키는데 필요한 첨가제와 생산과정에서 유래하는 불순물을 포함하지만, 해당물질의 안정성이나 조성의 변화에 영향을 주지 않고 분리될 수 있는 용매는 제외함(1)

시험물질(Test chemical) : "시험물질"은 무엇을 시험하였는지 언급할 때 사용 됨

UN의 화학물질의 분류 및 표시에 관한 국제조화시스템(United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, UN GHS) : 물리적, 보건적, 환경적 유해성의 수준 및 표준화된 유형에 따른 화학물질(화합물 또는 혼합물)의 분류체계로, 그림문자, 표시방법, 유해 사항, 사전 주의사항, 안전정보지 등의 소통 방식을 통해 화학물질의 유해 정보를 전달하여, 사람(고용주, 근로자, 운송자, 소비자, 응급처치자 등)과 환경을 보호하고자 제시된 체계(1)

UVCB(Substances of unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials) : 조성이 알려져 있지 않거나 다양한 조성으로 이루어진 화합물, 복잡한 반응산물 또는 생물학적 물질

검증된 참고 시험법(Validated Reference Method, VRM) : 과학적으로 유효한 것으로 승인되고 유사시험법으로 검증 연구를 위한 참고 자료로 사용되는 첫 번째 시험법.

검증된 시험법(Validated test method) : 특정 목적에 있어 충분한 상관성과 신뢰도를 가지며, 과학적으로 타당한 원리에 근거한 시험법. 절대적 의미에서 완벽하게 검증되지 않았지만 특정 목적에 대해 검증된 시험법(3).

Xeno-free : 사용된 세포와 동일한 종(이 경우에는 인간)에서 유래하지 않은 어떤 물질도 포함하지 않음.

별첨 2. 번역본 (OECD TG 442D 부속서 1B)

생체외 피부감작성 : ARE-Nrf2 루시퍼라아제 LuSens 시험법

In Vitro Skin Sensitisation: The ARE-Nrf2 Luciferase LuSens Test

초기 고려 사항, 적용 및 제한점

1.	본 가이드라인 442D 부록에 기술된 시험법은 루시퍼라아제, Nrf2 매개 항산화 반응 요소(ARE) - 의존 유전자의 발현 변화로 평가되는 피부감작성 독성발현경로(1)의 두 번째 핵심 단계로, 각질세포의 활성화를 설명한다. 피부감작성 물질은 ARE(2)(3)에 의해 조절되는 유전자 전사를 유도하는 것으로 보고되었다. 피부감작성 물질과 같은 저분자 친전자성 물질(small electrophilic substances)은 감지 단백질(sensor protein) Keap1 (Kelch-like ECH- 관련 단백질 1)에 작용할 수 있다. 그 시스테인 잔기가 공유 결합으로 변형되어 전사 인자 Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2)로부터 해리된다. 해리된 Nrf2는 phase II 해독효소를 코딩하는 유전자와 같은 ARE 의존성 유전자를 활성화시킨다(2)(4)(5).

2.	생체외 ARE-Nrf2 루시퍼라아제 LuSens 시험법(이하 LuSens 시험법)은 EURL ECVAMU(European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing)(10)에 의한 독립적인 전문평가를 거쳤으며, 그 후 검증된 참고 시험법인 KeratinoSensTM(6)(7)(8)(9)에 기초하여 유사시험법평가기준 기반 검증 연구를 마쳤다. LuSens 시험법은 통합독성평가(IATA)의 한 요소로 활용되어 과학적 타당성을 보여주었으며, 이에 따라 본 시험법은 위험성 확인을 위한 목적으로 피부감작성 물질과 비감작성 물질을 분류하는데 활용가능하다(10).

3.	LuSens 시험법은 숙련된 세포 배양 기술을 갖춘 실험실에 전수가 가능하고, 실험실 내 및 실험실 간에 요구되는 재현성 유사시험법평가기준을 충족한다(10). 72개의 시험물질에 대한 이전 연구에서 얻은 추가 정보는 LLNA 결과(7)(10)와 비교 시, 비감작성물질로부터 피부감작성 물질(예를 들면, UN GHS Cat. 1)을 구별하는 검증된 참고시험법(VRM)(74% 정확도, 74% 민감도, 74% 특이도)으로서 유사한 예측력을 나타냈다. 이는 LuSens 시험법이 피부감작성 확인에 기여할 수 있음을 나타낸다. 그러나 본 시험법은 일반적 개요의 7, 8번 항에 따라서, 규정된 접근법(Defined Approach) 또는 통합독성평가(IATA) 맥락에서 다른 정보와 결합되어 사용되어야 하며, 독립적(stand-alone) 시험법인 LuSens 시험법으로 정확도 값은 단순 지표에 불과하다. 또한, 피부감작성을 비동물 시험법으로 평가할 때, 다른 동물 시험법뿐만 아니라 LLNA 시험법도 인체에 미치는 영향을 완전히 반영하지 못한다는 것을 염두에 두어야 한다.

4.	현재 이용 가능한 데이터에 따르면 LuSens 시험법은 다양한 유기 작용기, 반응기전, 피부감작능(생체외 시험에서 확인한 바와 같이), 물리화학적 성질을 가지는 시험물질에 적용할 수 있다(7)(8). 본 시험법은 가용성이거나 시험물질처리 배지(exposure medium)에서 안정하게 현탁(즉, 시험물질이 용매로부터 침전되거나 층이 분리되지 않는 콜로이드 또는 현탁액)되는 시험물질에 적용된다. 최종 최고 시험 농도(즉, 시험물질 2000 μM 또는 분자량이 명확하지 않은 경우 2000 μg/mL)에서 이 같은 조건을 충족하지 못한 시험물질은 더 낮은 농도에서 시험할 수 있다. 그러한 경우, 양성 기준을 충족하는 결과는 피부감작물질을 확인하는데 이용될 수 있다. 시험물질 2000 μM (또는 분자량이 없을 경우 2000 μg/mL 미만)미만의 최대 농도에서 음성 결과가 나오고 세포 독성이 관찰되지 않는 경우 결과는 미결로 간주해야 한다(32항의 예측 모델). 시험물질 농도 2000 μM (또는 분자량이 없을 경우 2000 μg/mL)미만에서 세포 독성 (생존율<70%)이 나타나면 음성 기준을 적용할 수 있다. 일반적으로 7 이상의 LogP를 갖는 단일성분물질은 시험물질처리 배지(exposure medium)에 불용성일 수 있으나 가용성 또는 안정한 현탁액이 얻어지고 문서화 되면, 시험을 여전히 수행할 수 있다.

5.	Keap1-Nrf2-ARE 경로의 활성화를 유도하는 중요한 기전이 Keap-1의 친핵성 티올(시스테인 설프하이드릴 그룹)과 관련된 스트레스 인자(stressor)의 전자친자성(electrophilic) 반응인 것으로 나타나기 때문에, 라이신-잔기에만 반응성을 보이는 물질은 이 시험법에서 음성으로 나올 수 있으므로 음성 결과는 주의 깊게 해석해야 한다. 펩티드 반응성 분석(peptide reactivity assay)에서 얻은 보완적인 정보는, 이 불확실성을 줄일 수 있으며, 특히 시스테인과 라이신의 반응 구분에 대한 확실성을 향상시킬 수 있다. 또한, 사용된 세포주의 제한된 대사 능력(12) 및 실험 조건 때문에, 특히 산화 속도가 느린 프로합텐(pro-haptens, P450 효소를 통해 효소 활성화가 필요한 화학물질)과 프리합텐(pre-hapten, 자기산화에 의해 활성화되는 화학물질)의 경우도 음성 결과를 생성할 수 있다. 그러나 대부분의 프로합텐(pro-haptens, P450 효소를 통해 효소 활성화가 필요한 화학물질)과 프리합텐(pre-hapten, 자기산화에 의해 활성화되는 화학물질)은 독성발현경로에서 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 핵심 단계를 다루는 시험법의 조합으로 충분히 잘 확인되기 때문에, 음성 결과들은 일반적으로 분류를 위하여 잘 사용될 수 있다(13)(14)(15). 반면에, 감작성물질은 아니지만 화학적 스트레스 인자인 시험물질은 검증된 참고시험법에서 나타난 것처럼 위양성 결과를 초래할 수 있다(11). 마지막으로, 루시퍼라아제 효소활성에 간섭하는 시험물질은 세포 기반 시험에서 루시퍼라아제의 활성을 교란시켜 발광(luminescence)을 확연히 증가시키거나 감소시킬 수 있다(16). 예를 들어 1 μM 이상 농도의 식물에스트로겐은 다른 루시퍼라아제-기반 리포터 유전자(repoter gene)를 과활성시켜 발광 신호를 간섭한다고 알려져 있다(17). 따라서 고농도의 식물에스트로겐 또는 식물에스트로겐과 같이 루시퍼라아제 리포터 유전자를 과활성시키는 유사한 화합물에서 얻어진 루시퍼라아제 발현 결과는 신중하게 검토되어야 한다(17). 기타 다른 특정 범주 화합물에 대하여 LuSens 시험법을 적용할 수 없다는 증거가 제시되는 경우에는 본 시험법을 사용하지 말아야 한다.

6.	LuSens 시험법은 피부감작성 물질(예를 들면, UN GHS 카테고리 1)과 비감작성 물질을 구별하는 것 외에도, 검증된 참고시험법에서 기술된 IATA와 같은 통합된 접근 방식 내에서 사용되는 경우 감작능 정도(potency) 평가에 도움이 될 수 있는 정보(예, 용량-반응)를 제공해준다(13). 그러나 LuSens 시험법 결과가 통합독성평가(IATA) 맥락 안에서 어떻게 피부감작능 정도를 평가하는데 사용될 수 있는지를 파악하기 위해서는 더 많은 연구(예, 인체 데이터에 바탕을 둔 연구)가 요구된다. 다른 정보와 조합에 있어 ARE-Nrf2 루시퍼라아제 시험법이 어떻게 사용되는지의 예가 보고되어 있다(15)(18).

7.	정의는 별첨 1의 부록 1에서 제공된다.

시험의 원리

8.	LuSens 시험법은 랫드 NQO1 유전자의 항산화 반응 요소의 조절을 받는 루시퍼라아제 리포터 유전자를 안정적으로 도입한 인체 각질세포로부터 유래된 부착성 불멸화 세포주(immortalised adherent cell line)를 사용한다. NQO1과 같은 ARE에 의존하는 유전자는 감작물질에 의해 상향조절(up-regulation) 되는 것으로 알려져 있다(21)(22). 세포주는 ARE 요소(7)와 결합된 프로모터(promoter fused with the ARE element)의 전사 조절을 받는 루시퍼라아제 유전자를 포함하고 있다. 루시퍼라아제 신호는 감작물질이 내인성 Nrf2 의존성 유전자를 활성화 하는 것을 나타낸다. 재조합 세포주에서 루시퍼라아제 신호의 Nrf2에 대한 의존성은 검증된 참고 시험법(23)에서 직접‧간접적으로 입증되었다. 발광하는 루시퍼라아제 기질을 사용하여 루시퍼라아제 유전자 발현 유도의 정량적 측정(발광 검출)이 가능하며, 이는 전자친화성 시험물질에 노출된 후 Nrf2 전사 인자의 활성을 나타내는 지표로서 활용된다.

9.	LuSens 시험법에서 시험물질이 양성으로 판정되는 경우는, 세포 생존율 (예를 들면, 세포 생존율이 70% 이상)에 영향을 주지 않는 최소 두개의 연속 농도에서, 통계적으로 유의하게 주어진 역치(예를 들면, 1.5 배 이상 또는 50% 증가) 이상으로 루시퍼라아제 활성을 유도한 경우이다(7)(8). 이를 위해, 용매/부형제 대조군과 비교하여 루시퍼라아제 활성 유도 정도를 결정한다. 또한 세포독성 이하에서 루시퍼라아제 활성 유도 발생여부를 평가해야 한다.

10.	본 가이드라인의 LuSens 시험법을 일반적으로 사용하기 전에 실험실은 이 별첨2의 부속서 IB - 부록 1에 수록된 10개의 숙련도 물질을 사용하여 기술 숙련도를 입증해야 한다.

시험절차

11.	LuSens 시험법에 대한 DB-ALM(DataBase on ALternative Methods) 프로토콜을 이용할 수 있으며, 시험법 시행 시 이용되어야 한다(24). 검증된 참고시험법과 비교한 LuSens 시험법의 주요 프로토콜 단계에 대한 요약은 이 부속서ⅠB의 부록 2에서 확인할 수 있다. 본 시험법을 수행하는 실험실은 시험법 개발자에게 요청하여 시험법에 사용되는 재조합 세포주를 구할 수 있다. 루시퍼라아제 리포터 유전자 분석은 Promega의 사용 제한 라이선스의 적용을 받음에 따라, 다음 사항이 요구된다. i) Promega에서 구입한 발광도 분석 시약을 사용하거나 ii) Promega에 연락하여 상업적 사용을 위한 무료 라이센스를 취득한다. 다음 단락에서는 LuSens 시험 방법의 주요 요소와 과정에 대해 설명한다.

각질세포 배양 준비

12.	ARE- 요소에 의해 조절되는 루시퍼라아제 리포터 유전자가 안정적으로 삽입된 LuSens 형질전환 세포주(transgenic cell line)를 사용해야 한다. 세포주를 수령하면 1-3 계대(passage) 증식시키고 균질한 조건으로 세포(stock)를 냉동 저장한다. 수령한 세포의 계대 수로부터 최대 20 계대 수까지 계대할 수 있으며, 적절한 성장 배지(예를 들어, 혈청이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM)을 사용하며, 항생제는 선별을 위한 목적으로 퓨로마이신을 사용하고, 오염을 방지하기 위한 목적으로 페니실린/스트렙토마이신을 사용)와 배양조건이 시험에 사용된다. 그러나 시험 중에는 배지에 항생제를 넣지 않는다.

13.	시험에 사용하기 위해서 세포 포화도(confluent)가 80-90%정도 되어야 하며,  100%가 되지 않도록 주의한다. 시험 전날 적절한 세포 밀도 (예를 들면, 1X104 cell/well)로 96-well 플레이트에 분주한다. 세포의 균질한 분산을 위해 세포 분주(seeding) 과정에서 세포가 침전되지 않도록 주의한다. 그렇지 않은 경우, well 간 변동성이 높아진다. 각 시험물질 농도에 대해 3개의 반복시료(replicate)가 사용된다.

시험물질 및 대조물질의 준비

14.	시험 당일, 시험물질 및 대조물질을 준비한다. 시험물질은 dimethyl sulfoxide (DMSO, CAS 번호 67-68-5, 99% 순도)와 같은 적절한 용매에 시험 최대 농도 (예: 200 mM)에 도달하는 농도로 용해한다. DMSO 용액은 자체 멸균된 것으로 간주되므로, 멸균여과 처리가 필요하지 않다. 시험물질이 DMSO에 용해되지 않는 경우, 멸균수 또는 배양배지에 용해하며, 이 때 최종 용액이 멸균 상태가 되도록 한다. 분자량(MW)이 정의되지 않은 시험물질의 경우, 원액(stock solution)을 200 mg/mL 또는 20% (w/v)의 기본농도로 준비한다. DMSO, 물 또는 배양 배지 이외의 용매가 사용되는 경우, 적절한 과학적 근거가 제시되어야 한다.

15.	DMSO로 용해시킨 시험물질 원액을 DMSO로 연속 희석하여 12개의 초기 희석단계(master) 용액을 만든다. DMSO에 용해되지 않는 시험물질은 멸균수 또는 배양배지로 희석하여 초기 희석단계(master) 용액을 만든다(예: 0.098부터 200 mM 범위의 12개 농도). 사용한 용매와 상관없이, 초기 희석단계(master) 용액은 혈청을 함유한 배양배지로 25배 더 희석하고, 최종적으로 4배 더 희석하여 사용한다. (예: 희석배수 2를 기준으로, 0.98에서 2000 μM). 분자량이 명확하지 않은 시험물질의 경우, 최종 희망 농도를 얻기 위해 DMSO 또는 적합한 용매를 사용하여 연속 희석한다(예: 0.98~2000 µg/ml).

16.	세포독성 용량설정(cytotoxicity pre-range dose finding test) 시험을 첫 번째로 수행한다. 예를 들어, 위 농도에서 세포생존율이 75%로 감소되는 농도(CV75)를 결정한다. CV75는 루시퍼라아제 시험 및 동시에 시험하는 세포 독성시험에서 시험할 농도를 결정하기 위한 기준으로 사용된다(예를 들어, CV75보다 높은 농도, CV75 및 CV75보다 낮은 4가지 농도(CV75/2.07, CV75/1.73, CV75/1.44, CV75/1.2, CV75 및 CV75x1.2 μM)는 연속 희석 배수 1.2를 사용하여 희석). 타당성이 인정되는 경우(예: 너무 낮거나 너무 높은 세포 독성 또는 낮은 용해성의 경우), 대체 농도를 사용할 수 있다(24).

17.	용매/부형제 대조군(예, DMSO)은 각 반복시험마다 동시에 사용해야 하며, 플레이트당 충분한 수량의 well을 준비 한다(예를 들어, 세포독성 용량 설정 시험의 경우는 12 well, 프로토콜에서 기술된 루시퍼라아제 시험의 경우는 24well이 필요하다). 용매/부형제 대조군은 제 15항의 초기 희석단계(master) 용액에 대해 기술된 것과 동일한 희석과정을 거치므로, 최종 용매/부형제 대조군 농도는 시험물질 및 양성대조군과 동일한 농도(즉, 1%)이어야 하고, 세포생존율에 유의한 영향을 주지 않아야 한다. 사용된 용매(예: DMSO)에 용해되지 않는 시험물질의 경우, 그 희석물질이 물에 희석된 경우, 이 시험물질의 최종 시험 용액에서 모든 well의 용매 수준은 다른 시험물질 및 대조물질(즉, 1%)에 사용된 용매 농도와 동일하게 조정되어야 한다.

18.	음성대조군 역시 각 반복 시험마다 동시에 사용되어야 하며, 플레이트당 충분한 수량의 well이 준비되어야 한다(예를 들어, 세포 독성 용량 설정 시험의 경우 3개, 프로토콜에 설명된 루시퍼라아제 시험의 경우 6개(24)). LuSens 시험법에서 동시에 수행되는 음성대조군은 비감작성으로 알려진 DL-Lactic acid (CAS 번호 50-21-5, 순도 99% 이상) 5000 μM (또는 450 μg/mL)이며, LuSens 시험법으로 음성 예측된다. 과거 데이터에서 인정요건을 충족하는 경우, 다른 적절한 음성대조군을 사용할 수 있다. 또한, LuSens 시험법에서 아무것도 넣지 않은 배지 대조군를 포함하여 충분한 수량의 well(예를 들어, 세포 독성 용량 측정 시험의 경우 6개, 프로토콜에 설명된 루시퍼라아제 시험의 경우 12개(24))을 준비한다.

19.	동시에 수행되는 양성대조군은 시험계의 적절한 반응을 입증하기 위해, 각 반복시험 마다 충분한 수량의 well에서 시험해야 한다(예: 세포 독성 용량 설정 시험의 경우 2개, 프로토콜에 제시된 루시퍼라아제 시험의 경우 5개(24)). LuSens 시험법의 경우, 120 μM Ethylene Glycol Dimethacrylate (EGDMA, CAS No. 97-90-5, 99% 이상의 순도)가 사용된다. 양성대조군은 14항의 초기 희석단계(master) 용액과 시험법의 프로토콜(24)에 설명 된 것과 동일한 희석 단계를 거쳐 준비한다. 120 μM의 양성대조군 농도에서 독성이 너무 높거나 루시퍼라아제를 2.5배 (31항 참조)이상 유도하지 않는 경우(예를 들어, 새로운 실험실 시설 또는 새로운 EGDMA(new batch) 사용 이유 등으로), 루시퍼라아제가 용매/부형제 대조군에 비해 2.5 배 이상 유도되고 세포 생존율은 70% 이상인 농도(두 번 이상 실험하여 확인된)를 설정하기 위해, EGDMA로 범위 결정 시험을 수행할 수 있다. 마지막으로, 만일 인정요건을 충족하는 과거 데이터가 있는 경우, 다른 적절한 양성대조군(중간 범위의 EC1.5에 해당되는 것을 선호)을 사용 할 수 있다.

시험물질 및 대조물질의 적용

20.	각 시험물질과 양성대조물질들을 각각 3개의 반복시료를 포함하여, 최소한 두 번의 독립적인 반복실험(repetitions)이 필요하다(n=6). 두 번의 독립적인 반복실험 사이에서 결과가 불일치한 경우, 3개의 반복시료가 포함된 세 번째 반복실험을 실시해야 한다(n=9). 독립적인 개별 반복실험은 새로운 시험물질 원액(fresh stock solution)을 사용하여 다른 날 실시하고, 세포도 별도로 채취한다. 하지만 반복시험 시 같은 계대수의 세포를 사용할 수 있다.

21.	13항에서 기술된 바와 같이 세포를 96-well 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 분주하여 24시간 배양한다. 이어, 배지를 제거하고, 새로운 시험용배지(예를 들면, 시험법 프로토콜(24)에 기술된 바와 같이, 혈청을 포함하고 항생제를 제외한 DMEM 150 µL)로 교환하고, 50 µL의 25배 희석된 시험물질 및 대조물질을 첨가한다. 발광도 배경값(backgroud values)을 측정하기 위해, 플레이트당 최소 well 하나씩은 비워두어야 한다(세포 및 물질처리가 없는 상태).

22.	시험물질이 처리된 플레이트는 37±1℃, 5% CO2 조건에서 48시간 배양한다. 시험물질을 배양하는 동안, 호일(foil)로 플레이트를 덮어두는 등, 휘발성 시험물질의 증발과 well 간 교차오염을 방지하기 위해 주의가 필요하다.

루시퍼라아제 활성 측정

23.	적절한 발광도 측정을 위해 다음 요소가 중요하다.

• 감도가 좋은 발광측정기(luminometer) 선택

• 빛의 교차오염(light-cross-contamination)을 막을 수 있도록 충분히 높은 플레이트 사용

• 충분한 감도(sensitivity)와 낮은 변동성(variability)을 위해, 빛을 충분히 발산하는 루시퍼라아제 기질(substrate) 사용

• 적절하고 안정적인 배경 수준.

시험 시작 전에, 이 부속서ⅠB의 부록 3에서 설명한 대조실험 설정을 수행하여 세 가지 사항을 충족해야 한다.

24.	세포를 시험물질 및 대조물질에 48시간 동안 처리한 후, 인산완충 생리식염수(PBS)로 세척하고, 빛 판독을 위해, 적절한 용해 완충액(lysis bufer)을 각 well에 첨가하여 충분한 시간(예 : 5-10 분간) 동안 반응시킨다.

25.	시험법의 프로토콜(24)에 적절한 프로그램을 사용하여, 발광측정기 위에 놓인 세포 용해물(lysate) 플레이트를 판독한다. 사용된 발광측정기 모델 등에 따라 다른 설정을 이용한 경우, 타당한 사유를 밝혀야 한다. 또한, 본 부속서ⅠB의 부록 3의 품질 관리 시험을 확인하기 위해, 글로우 기질(glow substrate)을 사용할 수도 있다.

세포 독성 측정

26.	세포생존율 분석을 위해, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl- tetrazolium bromide, Thiazolyl blue tetrazolium bromide; CAS No. 298-93-1) 를 함유한 새로운 배지로 교환 후, 37±1℃, 5% CO2 조건에서 약 2시간 동안 배양한다. 이어, MTT 배지를 제거하고 적절한 용해제(lysing agent)(예: DMSO 중 10% (w/v) SDS 및 0.4% (v/v) 초산 용액의 경우 5분)를 사용하여 세포를 충분한 시간동안 진탕하여(shaking) 용해시킨다. 본 시험법 프로토콜(24)에 기술된 매개변수(parameters)를 사용하여 흡광도를 측정한다.

시험결과 및 보고

데이터 평가

27.	LuSens 시험법에서 다음 매개변수들을 계산한다(부속서ⅠB의 부록 4 참조):

• 시험물질의 각 농도(CV75/2.07, CV75/1.73, CV75/1.44, CV75/1.2, CV75 및 CV75x1.2 μM), 양성대조군 및 음성대조군에서 루시퍼라아제 활성 유도 배수(fold luciferase activity induction)

• 세포생존율 75%가 되는 농도값(CV75)을 (내삽법으로) 계산하기 위해, 시험물질의 각 농도 및 모든 대조군에서의 세포생존율

28.	루시퍼라아제 활성을 1.5배 이상 유도하는 각각의 시험농도에서(two-tailed Student’s t-test 등으로 얻은), 루시퍼라아제 활성 유도가 통계적으로 유의한지(p<0.05) 여부를 평가하기 위해, 3개의 반복시료와 용매/부형제 대조군의 발광도 값을 비교하여통계적 유의성을 확인한다. 또한, 이러한 농도에서 유의한 세포독성 효과가 나타나는지 여부를 확인해야 한다(즉, 1.5 배로 루시퍼라아제를 유도하는 농도에서의 세포 생존율은 70%이다).

29.	각 농도의 발광도 값의 데이터를 그래프로 나타내는 것을 권장한다. 만약 용량-반응이 명확하지 않거나, 2상(biphasic)의 형태(1.5배 역치가 두 번 겹치는)로 나타나는 경우, 시험물질의 특성인지 또는 실험상의 오류인지를 확인하기 위한 재시험을 실시해야 한다. 각 시험에서 2상(biphasic)형태의 반응이 재현되는 경우, 더 낮은 농도(즉, 1.5배(EC1.5) 역치를 처음으로 초과하는 농도)를 정해야 한다. 그러나 EC1.5 농도를 도출하는 것은 필수 사항이 아니다.

30.	마지막으로, LuSens 시험법에서 가장 낮은 시험농도(예: CV75/2.07)에서만 1.5 배 이상 루시퍼라아제 활성 유도가 관찰되면, 더 낮은 농도를 적어도 하나 이상 추가하여 재시험을 실시해야 한다.

인정요건

31.	LuSens 시험법은 다음의 인정요건을 충족해야 한다. 아래 요건 중 하나라도 충족되지 않으면, 새로운 반복시험을 수행해야 한다.

• 양성대조군 120 μM EGDMA (또는 유사한 농도 - 19 항 참조)에서 얻은 루시퍼라아제 평균 활성 유도는 용매/부형제 대조군과 비교하여 2.5배 이상이어야 하고, 세포생존율은 70% 이상이어야 한다.

• 음성대조군 즉, 5000 μM DL- Lactic acid에서 얻은 루시퍼라아제 평균 활성 유도와 미처리 세포의 기저 발현(basal expression of untreaed cell)은 각각 용매/부형제 대조군 평균 대비 1.5배 미만이어야 한다.

• 용매/부형제 대조군(예: DMSO)에 대한 발광도 측정의 평균 변동 계수는 각각의 반복시험에서 20% 미만이어야 한다.

• 최소한 3개의 시험물질 농도에서 세포생존율은 용매/부형제 대조군 대비 70% 이상이어야 한다. 또한, 결과가 음성으로 판정될 경우, 최소한 한 개의 농도에서는 세포 독성을 보여야 한다. 예를 들면, 세포 생존율 <70% 또는 최대 농도 2000 μM (또는 분자량이 명확하지 않은 물질의 경우 2000 μg/mL)를 포함해서 시험이 수행되어야 한다.

32.	경우에 따라, 일부 시험물질이 세포 독성을 유발하지 않을 수 있으며, 이 경우시험물질의 최대 농도는 2000 μM (또는 분자량이 명확하지 않은 경우 2000 μg/mL)에서 수행되어야 한다. 루시퍼라아제 시험 농도에서 세포 독성(70% 미만의 세포생존율)이나 루시퍼라아제 활성 유도가 충분히 나타나지 않는 경우, 두 번째 반복시험을 수행해야 한다. 이때는 1.2 연속 희석 배수가 아닌, CV75에 기초한 1.44 연속 희석 배수를 사용한다(1.44 x CV75로 시작). 두 번째 반복시험에서, 세포 독성과 루시퍼라아제 유도가 여전히 관찰되지 않으면, 최대 농도 2000 μM (또는 분자량이 명확하지 않은 물질의 경우 2000 μg/mL)에서 세 번째 반복시험을 수행해야 한다. 세 번째 반복시험의 결과는 네 번째 반복시험을 통해 확인되어야 한다.

결과의 해석 및 예측모델

33.	LuSens 시험에서, ⅰ) 두 번 반복실험에서 두 번 모두 또는 ⅱ) 세 번 반복실험에서는 두 번에 걸쳐, 다음의 조건이 모두 충족하는 경우 양성으로 판정하고, 그렇지 않은 경우는 음성으로 판정한다(그림 1).

• 세포독성(즉, 세포 생존율이 70% 이상)이 없는 두 개의 연속적인 시험농도(consecutive non-cytotoxic tested concentrations)에서, 용매대조군과 비교 시, 통계적으로 유의하게 루시퍼라아제 유도가 1.5 배 이상이어야 한다. 또한 적어도 세 개의 시험 농도에서는 세포 독성이 없어야 한다(세포 생존율은 70% 이상).

34.	또한, 안정한 현탁액을 형성하지 않거나 2000 μM (또는 분자량이 명확하지 않은 시험물질의 경우 2000 μg/mL)까지 시험되지 않는 경우 또는 어떤 농도에서도 세포 독성이 나타나지 않은 시험물질에서 얻은 음성 결과(31항 참조)는 미결(inconclusive)로 간주한다(4항 참조).

그림 1 LuSens 시험법에 예측을 도출하는 기준의 개요

시험보고서

35.	시험보고서는 다음 사항을 포함해야 한다.

시험물질

• 단일성분물질

o IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호, SMILES 또는 InChI 코드, 구조식 및/또는 배치/lot 번호 및 유효기간과 같은 기타 식별자료 등의 화학물질 식별 정보

o 물리적 성상, 용해도, DMSO 용해도, 분자량 및 기타 관련 물리화학적 특성(확보 가능한 범위에서)

o 시험물질처리 배지(exposure medium)에서의 용해도 또는 분산 안정성에 대한 설명

o 순도, 불순물의 화학물질 식별정보

o 해당하는 경우, 시험 전 처리방법(예, 가온, 분쇄)

o 시험 농도

o 확보 가능한 범위에서 보관 조건 및 안정성.

• 다성분물질, UVCB 및 혼합물

o 물질의 특성(예: 화학물질 식별정보(위 참조), 확보 가능한 범위에서 순도, 함유량 및 해당 성분의 관련 물리 화학적 성질(위 참조))

o 물리적 성상, 용해도, DMSO 용해도 및 기타 관련 물리화학적 특성(확보 가능한 범위에서)

o 시험물질처리 배지(exposure medium)에서 용해도 또는 분산 안정성에 대한 설명

o 분자량 또는 조성이 알려진 혼합물/중합체의 경우 겉보기 분자량(apparent molecular weight) 또는 시험 수행 관련된 기타 정보

o 해당하는 경우, 시험 전 처리방법(예, 가온, 분쇄)

o 시험 농도

o 확보 가능한 범위에서 보관 조건 및 안정성.

*UVCB: Unknown or Variable composition, Complex reaction products or Biological materials

대조군

• 양성대조군

o IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호, SMILES 또는 InChI 코드, 구조식 및/또는 다른 식별자료 등의 화학물질 식별 정보

o 물리적 성상, 용해도, DMSO 용해도, 분자량 및 기타 관련 물리화학적 특성(확보 및 적용 가능한 범위에서)

o 순도, 불순물의 화학물질 식별정보

o 해당하는 경우 시험 전 처리(예: 가온, 분쇄)

o 시험 농도

o 확보 가능한 범위에서 보관 조건 및 안정성

o 해당하는 경우, 적합한 인정요건을 입증할 수 있는 기존 양성대조군 결과에 대한 참고자료

• 용매/부형제 대조군

o IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호 및/또는 다른 식별자료 등의 화학물질 식별 정보

o 순도, 불순물의 화학물질 식별정보

o 본 가이드라인에 언급된 것과 다른 용매/부형제가 사용된 경우, 물리적 성상, 분자량 및 기타 관련 물리화학적 성질

o 확보 가능한 범위에서 보관 조건 및 안정성

o 각 시험 물질의 용매/부형제 선택에 대한 근거 제시

• 음성 대조군

o IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호 및/또는 다른 식별자료 등의 화학물질 식별 정보

o 순도, 불순물의 화학물질 식별정보

o 본 가이드라인에 언급된 것과 다른 음성 대조군/부형제가 사용된 경우, 물리적 성상, 분자량 및 기타 관련 물리화학적 성질

o 확보 가능한 범위에서 보관 조건 및 안정성

o 본 가이드라인에서 것과 이외의 다른 음성대조군이 사용된 경우, 음성대조군 선택에 대한 근거 제시

시험 방법 조건

• 시험의뢰자, 시험기관, 시험책임자의 이름과 주소

• 사용된 시험법에 대한 설명

• 사용한 세포주, 세포주 보관 조건과 공급처(예: 세포주 제공 기관)

• 세포주의 계대수, 시험에 사용된 세포 포화도(confluent)

• 시험 전 세포 분주(seeding) 시 사용한 세포수 측정 방법과 균질한 세포수 배분에대한 방법(13항 참조)

• 사용된 발광측정기(예, 모델), 기기 설정, 사용된 루시퍼라아제 기질(substrate), 부속서ⅠB의 부록 3에서 설명한 대조실험에 근거한 발광도 측정의 적절성 제시

• 시험 수행(예: 숙련도 물질 시험) 실험실의 숙련도 및 재현성  입증을 위한 절차

시험 절차

• 반복실험(repetitions)과 반복측정(replicates)의 횟수

• 시험 물질 농도, 시험 물질 처리 절차, 처리 시간(권장과 다를 경우)

• 사용된 평가 및 결정 기준에 대한 설명

• 사용된 인정요건에 대한 설명.

• 시험 절차의 모든 변경 사항에 대한 설명

결과

• 개별 반복실험의 시험물질과 양성대조군로부터 얻은 루시퍼라아제 유도 활성 및 생존율 (예: LuSens 시험법에 대한 CV75)의 도표화;

• 모든 개별 반복실험 값으로부터 계산된 평균값 (예를 들면, 세포생존율 및 루시퍼라아제 활성 유도의 산술평균) 및 표준편차

• 예측모델에 따른 시험물질의 등급 표시;

• 각 시험에 대한 용매/부형제 대조군 발광도 측정 값의 변동계수

• 루시퍼라아제 활성 유도와 생존율에 대한 용량-반응 곡선 그래프

• 해당되는 경우, 다른 관련된 관찰사항에 대한 기술

결과에 대한 고찰

• LuSens 시험법 결과에 대한 고찰

• 기타 관련 정보가 있는 경우, IATA 내에서 시험법 결과에 대한 고려사항

결론

부속서 IB - 부록 1 : 숙련도 물질

생체외 피부 감작성 : ARE-Nrf2 루시퍼라아제 LuSens 시험법

본 가이드라인 442D 부록을 준수한 시험법의 본격적으로 이용하기 전에, 실험실은 표 1에서 권고하는 숙련도 물질 10종을 정확하게 예측하고, 숙련도 물질 중 최소 8종 이상에 대해 각 기준 범위를 충족하는 raw 값을 구하여, 기술적 숙련도를 입증하여야 한다. 이 숙련도 물질들은 피부감작 유해성의 반응 범위를 나타내기 위해 선정되었다. 다른 선정 기준으로는 상업적 구매 가능성 여부, 신뢰할 만한 생체내 데이터 및 LuSens 시험법에서 나온 생체외 데이터의 참고가능 여부가 해당된다.

표 1 : LuSens 시험법에서 기술 숙련도를 입증하기 위해 이용되는 권장 물질.

숙련도 물질	CASRN	물리적 형태	LLNA 예측1)	Human category2)	LuSens
					In Vitro 예측3)	EC1.5 (μM) 참조 범위4)	CV75 (μM) 참조 범위4)
Salicylic acid	69-72-7	고체	비감작성	Cat. 6	음성	> 1000	> 2000
Glycerol	56-81-5	액체	비감작성	Cat. 6	음성	> 1000	> 2000
Isopropanol	67-63-0	액체	비감작성	Cat. 5	음성	> 1000	> 2000
Sulfanilamide	63-74-1	고체	비감작성	음성 (Basketter et al. 1994)	음성	> 1000	> 2000
Eugenol	97-53-0	액체	감작성 (weak)	Cat. 3	양성	< 500	< 1000
Cinnamyl alcohol	104-54-1	고체	감작성 (weak)	Cat. 3	양성	< 170	> 420
2-Mercaptobenzothiazole	149-30-4	고체	감작성 (moderate)	Cat. 3	양성	< 800	< 2000
4-Methylaminophenol sulfate	55-55-0	고체	감작성 (strong)	Cat. 3	양성	< 30	< 50
Methyldibromo glutaronitrile	35691-65-7	고체	감작성 (strong)	Cat. 2	양성	< 25	< 50
2,4-Dinitro-chlorobenzene	97-00-7	고체	감작성 (extreme)	Cat. 1	양성	< 5	< 10

1) LLNA 데이터에 근거한 유해성 및 그 정도에 대한 예측(25). 생체내 감작능(Potency)은 ECETOC가 제안한 기준을 이용하여 도출한다(24).

2) Basketter 및 그의 연구진(26)에 따르면. Cat. 1은 접촉성 알레르기를 명학하게 유발하고, Cat. 2는 빈번하게(frequent) 유발하고, Cat. 3는 일반적으로(common) 유발하고, Cat. 4는 드물게(infrequent) 유발하고, Cat. 5는 거의(rare) 유발하지 않으며, Cat. 6은 접촉성 알레르기를 유발하지 않는다.

3) ARE-Nrf2 루시퍼라아제 시험법 예측은 개요의 7 항과 8 항의 규정에 따라서 규정된 접근법(Defined Approach) 또는 통합독성평가(IATA)의 체계 내에서 고려가 필요하다.

4) 기존의 시험결과에 근거한다(7)(8). EC1.5는 LuSens 예측 모델의 일부의 필수요소는 아니지만, 시험결과로부터 계산이 가능하고, 숙련도 물질의 LuSens 반응 범위를 결정하는데 사용할 수 있다. EC1.5 값은 부록 IA (26 항)에 따라 계산되었다.

부속서 IB - 부록 2 : LuSens 및 검증된 참고시험법 KeratinoSensTM 의 주요 프로토콜 단계 비교

세포주 시험 단계	VRM (KeratinoSensTM)	LuSens
각질세포 배양 준비
증식(propagation)	2 ~ 4 계대	1 ~ 3 계대
저온보관	2 ~ 4 계대	3 계대
본실험 전 세포 계대수	최소한 2	최소한 5
냉동stock으로부터 최대 배양 계대수	25 계대	세포 독성 범위 시험에서 20 계대 루시퍼라아제 시험에서 15 계대
계대 배지	혈청과 Geneticin 함유 DMEM	혈청과 penicillin/streptomycin 및 puromycin 함유 DMEM
시험시 세포 포화도(confluent)	80-90%
시험 전 세포 채취 (harvest)	1 일
시험용 플레이트	96 well-플레이트
시험 접종 세포수	10.000 세포/well, 배경 측정에 사용되는 well은 제외
각 시험 농도 당 시료 수 (반복시험별)	루시퍼라아제 측정을 위한 (독립적인 플레이트 내) 3개의 well 1개의 well은 세포독성 평가에 사용	모든 시험은 (같은 플레이트 내) 3 개의 well에서 수행. -세포 독성 범위 측정 시험 및 루시퍼라아제 시험 (루시퍼라아제 측정을 위한 3개의 well 및 동시에 수행되는 세포 독성 평가를 위한 3개의 well을 포함)
시험물질 및 대조물질의 준비
준비	시험 당일
용매	DMSO, DMSO에 녹지 않는 시험물질의 경우 멸균수 또는 시험용배지	DMSO 또는 DMSO에 용해되지 않는 시험물질의 경우 시험용배지
시험물질 원액농도 (Stock concentration)	200 mM
분자량이 명확하지 않은 시험물질	기준 농도(40 mg/mL 또는 4% (w/v))로 준비된 stock 용액	기준 농도(200 mg/mL 또는 20% (w/v))로 준비된 stock 용액
96-well 플레이트 내 최종 시험 농도 범위	0.98 ~ 2000 μM 범위의 12개의 농도 (2배 희석)	세포 독성 범위 측정 시험 : 0.98 ~ 2000 μM 범위의 12개 농도 (2배 희석) 루시퍼라아제 시험 : CV75/2.074에서 CV75x1.2 μM 범위의 6개 농도 (1.2 배 희석)
용매대조군	1% DMSO (반복시험 별 18개의 반복시료)	1% DMSO (세포 독성 범위 측정 시험을 위한 반복시험 별 12 반복시료 및 루시퍼라아제 시험을 위한 반복시험별 24개의 반복시료)
음성대조군	용매대조군 참조	5000 M DL-Lactic acid (세포 독성 범위 측정 시험을 위한 반복시험별 3 반복시료 및 루시퍼라아제 시험을 위한 반복시험별 6개의 반복시료)
양성대조군	Cinnamic aldehyde 4 ~ 64 μM 범위의 4개의 농도 (2 배 희석) (반복시험 별 3개의 반복시료)	120 M EGDMA(Ethylene Glycol Dimethacrylate) 또는 루시퍼라아제를 2.5배 유도하고, 세포생존율은 70% 이상인 다른 농도 (세포 독성 범위 측정 시험을 위한 반복시험별 2개의 반복시료 및 루시퍼라아제 시험을 위한 반복시험별 5개의 반복시료)
배지대조군	해당없음	세포독성 범위설정 시험 시 시험 당 6개 시료 루시퍼라아제 시험 시 시험 당 12개의 시료
Blank 대조군(세포 없음)	반복시험별 3개의 반복시료	반복시험별 1개의 반복시료
시험물질, 대조물질, 평가 항목의 적용
각 시험물질 농도 당 반복시험 수	농도 당 각 3 개의 반복시료를 포함하여 독립적인 반복시험을 최소한 두 번 수행하며(n=6), 불일치 결과가 나타난 경우, 세 번째 반복시험을 수행해야 한다(n =9). 각 반복시험은 조제한 시험물질과 채취된 세포로 다른 날에 수행한다.
시험용 배지	혈청을 포함하고, 항생제(즉, Geneticin, penicillin/streptomycin 및 puromycin)를 제외한 150μl DMEM에 25배 시험물질 및 대조물질 50 ㎕를 넣는다
시험물질 처리 시간	시험물질을 처리한 플레이트를 5% CO2 배양기에서 37±1℃로 약 48시간 동안 배양한다. 휘발성 시험물질의 증발 및 well 사이의 교차 오염을 막기 위해 호일로 플레이트를 덮는다.
발광도 활성 측정	시험물질 처리 후, 세포를 인산완충 생리식염수(PBS)로 세척하고, 용해 완충액(lysis buffer)을 넣은 뒤 실온에서 20분 동안 방치한다. 세포 용해물(lysing agent)이 있는 플레이트를 판독을 위해 루미노미터에 놓고, 다음 프로그램을 따른다 i) 루시퍼라아제 기질을 각 well에 첨가하고, ii)1 초 동안 기다린 다음, iii) 2초 동안 루시퍼라아제 활성을 측정한다.	시험물질 처리 후, 완충액(lysis buffer)을 각 well에 첨가하고, 어두운 곳에서 5-10분 동안 교반한다. 루미노미터를 사용하여 2초 동안 발광도를 측정한다. 사용된 루미노미터에 따라 다른 조건을 적용할 수 있다.
세포 독성 평가	시험물질 처리 후, 5 mg/ml MTT 용액을 첨가하고 세포를 5% CO2, 37±1 ℃에서 4 시간 배양한다 이어서, 세포를 (10% SDS 용액으로) 밤새 용해시키고, 교반한 후 600 nm에서 흡광도를 측정한다.	시험물질 처리 후, MTT 용액 (0.5 mg/ml) 200 μL를 첨가하고, 세포를 5% CO2, 37±1℃에서 2 시간 배양한다. 세포를 5 분간 (10% (w/v) SDS 및 0.4% (v/v) 아세트산을 포함한 DMSO 용액) 용해시키고, 570 및 690 nm에서 흡광도를 측정한다
평가 항목	Imax : 모든 시험물질 농도에서 루시퍼라아제 활성 유도 최대치 EC1.5 : 루시퍼라아제 활성이 1.5 배 유도 되는 측정 농도 IC50/IC30 : 세포생존율이 각각 50% 및 30% 감소시키는 농도	각 시험물질 농도의 평균 루시퍼라아제 활성 유도 각 시험 농도의 평균 세포생존율 CV75: 세포생존율이 75%인 농도
인정 기준
양성대조군 루시퍼라아제 활성도	양성대조군(4~64 μM cinnamic aldehyde)의 하나 이상의 농도에서 통계적으로 유의한 1.5 배 이상의 활성도 유도 양성대조군의 EC1.5 값은 기존 평균(historical mean)의 2SDs (mean±SD 이내)(예 : 유효성 확인 데이터 세트에서 2 ~30 mM) 64 μM cinnamic aldehyde(의 평균 활성 유도는 2~ 8배 사이	세포독성이 없는 농도(용매대조군 대비 세포생존율 ≧ 70%)에서 용매대조군 대비 양성대조군(예 : 120M EGDMA)의 루시퍼라아제 활성도가 2.5 배 유도
음성대조군 루시퍼라아제 활성도	해당 없음	용매대조군 대비 음성 대조군 (5000 μM DL-Lactic acid)이 1.5배 미만으로 유도
배지대조군 변동성	변동 계수 = 20% (18개 반복시료)	변동 계수 = 20% (21개 반복시료)
기타	해당 없음	배지대조군(배지만 함유된 세포)의 평균 기저 발현은 용매대조군 대비 루시퍼라아제 활성 유도가 1.5 배 미만이어야 한다. (총 6개 농도를 적용하여 실험한 루시퍼라아제 시험 중)최소한 3 가지 시험 농도는 세포독성이 없어야 한다(세포생존율 = 70%). 음성 결과의 경우, (총 6개 농도를 적용하여 실험한 루시퍼라아제 시험 중) 최소 한 개의 시험 농도는 세포독성을 나타내야 한다(세포 생존률 <70%).
예측 모델
다음 조건이 2/2 또는 3/2 반복시험에서 충족되는 경우, - 예측은 양성으로 간주 - 그렇지 않은 경우, 음성으로 간주	Imax가 1.5 배 이상이고 용매대조군과 통계적으로 유의한 차이 (two-tailed, unpaired Student’s T-test)가 있다 세포생존율은 최저 농도에서 70%보다 높고, 루시퍼라아제 활성의 유도가 1.5 배 이상 (즉, 농도를 측정하는 EC1.5에서)이다 EC1.5 값은 1000 μM 미만 (또는 MW가 명확하지 않은 시험물질의 경우 200 μg/mL 미만)이다 루시퍼라아제 유도에서 명백한 전반적인 용량 의존적 증가가 있다	세포독성이 없는 최소 두 개의 연속적인 시험 농도(즉, 세포생존율이 70% 이상)에서, 용매대조군과 비교하여 1.5 배 이상의 루시퍼라아제 유도가 나타난다 적어도 3 가지 시험 농도는 세포독성이 없어야 한다(세포생존율은 70% 이상).
안정하게 현탁되지 않는 시험 물질	1000 μM 미만에서 안정하게 현탁되지 않는 시험물질의 음성 결과 (또는 분자량이 명확하지 않은 시험물질의 경우 <200 μg/mL)는 미결(inconclusive)로 간주 한다.	2000 μM 미만에서 안정하게 현탁되지 않는 시험물질의 음성 결과 (또는 분자량이 명확하지 않은 시험물질의 경우 2000 μg/mL 미만)는 미결(inconclusive)로 간주한다.

부속서 IB - 부록 3: 발광도 측정의 품질 관리

LuSens 시험법에서 최적의 발광도 측정을 위한 기본 실험

최적의 발광도 측정을 위해, 처음 분석 시 아래와 같이 플레이트 레이아웃을 하고EGDMA를 시험물질로 사용하여 농도를 증가하면서 LuSens 시험을 한 번 또는 두 번 수행하는 것을 권장한다. 이러한 반복시험을 수행 시 다음 측면을 고려해야 한다.

• EDGMA의 농도를 증가함에 따라, 루시퍼라아제 유도는 용량 의존적(dose-dependent)으로 증가해야 한다(well A-C : 1-6 wells).

• 플레이트 레이아웃 A~D : 8-12 wells의 발광도 값과 비교하여 D : 1-6 wells및 A-D : 7 wells의 발광도 값이 용량 의존적으로 증가하지 않아야 한다.

• 적어도 21 개의 용매/부형제 대조군(F-G : 1-12 wells)에서 변동성의 표준 편차 평균 백분율은 20% 미만이어야 하며 "경사 유사(gradient-like)"패턴을 보여서는 안 된다.

표 1: 발광도 측정 최적화 실험을 위한 플레이트 설치

부속서 IB - 부록 4: LuSens 시험 방법에 사용 된 계산

1.	루시퍼라아제 활성의 유도 배수(Imax)는 수식 1에 따라 계산되고, 전체적인 최대 유도 배수(Imax)를 개별 반복시험의 평균값으로 계산 된다.

수식 1:	Fold induction =	(Lsamplet-Lblank)
		(Lsolvent-Lblank)

Lsample  :	시험물질 well에서의 발광도 측정 값

Lblank   :	세포도 없고 어떤 처리도 하지 않은 발광도 측정값

Lsolvent  :	세포와 용매대조군을 포함하는 well에서 평균 발광도 측정값

2.	세포 생존율은 수식 2에 따라 계산된다.

수식 2:	Viability =	(Vsamplet-Vblank)	x100
		(Vsolvent-Vblank)

Vsample  :	시험물질 well에서 MTT- 흡광도 값

Vblank   :	세포도 없고 어떤 처리도 하지 않은 빈 well의 MTT- 흡광도 값

Vsolvent  :	세포와 용매대조군을 포함하는 well에서 평균 MTT- 흡광도 값

3.	세포생존율이 75%로 감소되는 농도(CV75)는 수식 3에 따라 선형 보간법(linear interpolation)으로 계산되며, 전체 CV75는 개별 반복시료의 기하 평균값으로 계산된다.

수식 3:	CV75 =	(Cb – Ca) ×	(75-Vb)	+Cb
			(Vb-Va)

Ca  :    세포생존율이 75% 이상인 최저 시험 농도(µM)

Cb  :    세포생존율이 75% 이하인 최고 시험 농도(µM)

Va  :    Ca로 얻은 % 생존율

Vb  :    Cb로 얻은 % 생존율

별첨 3. 원문 (OECD TG 442D Introduction, Appendix 1B)

“화장품 피부감작성 동물대체시험법

(ARE-Nrf2 루시퍼라아제 LuSens 시험법) 가이드라인(민원인 안내서)”

발행일 발행인 편집위원장 편집위원 도움주신분 문의처 주소	2019 년 6 월 식품의약품안전평가원장 독성평가연구부장 정자영 임경민, 안수선, 정미숙, 성낙원, 김배환, 양성준 식품의약품안전평가원, 특수독성과 Tel : 043-719-5153, 5155 Fax : 043-719-5150 충청북도 청주시 흥덕구 오송읍 오송생명 2로 187, 오송보건의료행정타운 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원