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[최신연구] 비건(Vegan) 인증 화장품원료 항산화능, 미백효과 연구

7종 혼합추출물 항산화능 약 8.28배 우수, 플라보노이드 함량 약 2.0배 우수, 미백효과 약 1.5배 우수 확인

# 비건(Vegan)인증 화장품 원료 7종 혼합추출물 항산화능, 미백효과 연구

 

1. 서론

 

최근 화장품 제조 과정 중 동물실험과 동물성 원료를 사용하지 않는 비건뷰티(vegan beauty)가 증가하고 있다. 실제로 무분별한 동물성 원료 사용은 생태계를 파괴시키는 요인으로 문제시 된 바 있다. 이미 유럽연합(EU)은 화장품지침 전문을 통해 화장품의 원료 또는 원료의 배합과정과 완성된 화장품의 안전성 평가를 시행해야 할 경우 86/609/EEC(동물실험보호를 규정한 지침)를 적용해야 한다고 규정했다1)2).

 

이러한 움직임은 세계 각국으로 확대되어 전 세계적으로 비건 화장품 시장의 높은 성장률을 가져왔다3). 현재 국내 기업들도 뷰티 시장 변화의 흐름을 반영해 동물성 원료 대신 자연 유래 친환경 성분을 사용해 화장품을 연구, 개발, 생산하는데 동참하고 있으며4), 소비자들 또한 비건 화장품에 대한 관심과 수요가 크게 증가하고 있어 비건뷰티는 필수가 되고 있다. 그러나 성장하는 비건 화장품 시장에 비해 아직 비건 화장품 원료에 대한 연구는 부족한 실정이며 꾸준한 연구가 필요하다.

 

따라서 본 연구에서는 Geranium maculatum Extract(와일드제라늄추출물), Oenothera biennis Flower Extract(달맞이꽃추출물), Diospyros kaki Leaf Extract(감나무잎추출물), Dandelion(Taraxacum officinale) Leaf Extract(서양민들레잎추출물), Eclipta prostrata Extract(한련초추출물), Salix alba Bark Extract(흰버드나무껍질추출물), Scutellaria baicalensis Root Extract(황금추출물)의 7가지 혼합추출물의 항산화와 미백효과를 연구해 비건 화장품 원료로서의 활용 가능성을 확인하고자 한다.

 

2. 실험방법


2-1. 추출물


실험에 사용한 7가지 추출물은 80℃ 열수추출 방식을 이용했으며 정제수에 원물은 1%의 비율로 제조했다. 항산화능 실험과 세포 실험을 위해 동결건조 방법으로 추출물의 건조중량을 측정한 후 얻어진 추출물은 증류수 1mg/mL 농도로 재용해시킨 뒤 동일 비율로 혼합했다. 혼합 추출물은 syringe filter(PVDF, 0.2μm)를 통해 균, 불용물을 제거했다.

 

2-2. DPPH 라디컬 소거능 측정


DPPH assay 측정을 위해 70% ethanol을 용매로 DPPH를 1%(w/v)가 되도록 녹인 뒤 filter paper를 이용해 불용된 DPPH를 제거했다. 이 후 용액의 520nm 흡광도가 1.00이 되도록 70% ethanol로 다시 희석해 DPPH 용액으로 사용했다. 2배씩 희석해서 만들어진 다양한 농도의 7가지 추출물 1.0mL와 DPPH 용액 1.0mL를 혼합 후 30분간 반응시킨 후 520nm에서의 흡광도를 측정했다. DPPH 실험결과는 ascorbic acid의 IC50를 측정 후 비교해 항산화능을 평가했다.

 

2-3. ABTS 라디컬 소거능 측정


ABTS assay 측정을 위해 발색되지 않은 7mM ABTS 용액에 2.45mM potassium persulfate를 녹여 12시간 동안 발색반응을 진행시켰다. 발색이 끝난 ABTS 용액의 740nm에서의 흡광도를 측정해 흡광도가 0.7이 되도록 희석해서 사용했다. 2배씩 희석해서 만들어진 다양한 농도의 7가지 혼합추출물 1.0mL와 ABTS 용액 1.0mL를 혼합 후 30분간 반응시킨 후 740nm에서의 흡광도를 측정했다. 실험결과는 ascorbic acid의 IC50를 측정 후 비교해 항산화능을 평가했다.

 

2-4. FRAP 측정

 

FRAP 측정을 위해 0.5mg/mL 농도로 희석한 7가지 추출물 2.5mL과 0.2M 인산염 완충용액(pH 6.6) 2.5mL 를 혼합해 일정한 pH가 나타나도록 했다. 이 후 10% 페리시안화 칼륨용액 2.5ml를 주입해 50℃에서 20분 동안 반응시켰으며 반응이 끝난 시료는 10% trichloroacetic acid 2.5ml를 넣은 뒤 원심분리(3000 × G, 15min)해 침전물을 제거했다. 침전물이 제거된 용액 1mL와 0.1% ferric chloride 용액 0.2mL를 혼합시킨 후 700nm에서 흡광도를 측정해 환원력을 평가했으며 FRAP 실험결과는 ascorbic acid를 기준으로 standard curve를 작성해 측정했다.

 

2-5. 폴리페놀 함량 분석


폴리페놀 함량을 분석하기 위해서 7가지 추출물 1.0mL와 증류수로 10배 희석된 Folin-Ciocalteu reagent 시약 0.1mL를 반응시킨 후 5분 동안 실온에서 방치한 후 CaCO3(5%, w/v) 1.0mL를 주입했다. 반응을 위해 30분간 방치 한 후 760nm에서의 흡광도를 측정했으며 폴리페놀 함량은 gallic acid를 기준으로 standard curve를 이용해 환산했다.

 

2-6. 플라보노이드 함량 분석

 

플라보노이드 함량을 알아보기 위해 7가지 추출물 1.0mL에 NaNO2 (5%, w/v) 0.3mL를 주입한 뒤 5분 동안 실온에서 방치한 후 AlCl3 (2%, w/v) 0.5mL를 주입한후 반응이 일어날 수 있도록 6분간 방치했다. 이 후 1M NaOH 0.5mL를 주입해 중화시킨 뒤 510nm에서의 흡광도를 측정했으며 플라보노이드 농도는 quercetin을 기준으로 standard curve를 이용해 환산했다.

 

2-7. 세포 독성 측정


세포 독성을 측정하기 위해 MTT assay를 실시했으며 먼저 배양된 B16F10을 96 well plate에 well 당 5×104 cell 을 주입해 24시간 배양했다. 배양이 끝난 후 2배 다단희석을 통해 6.25-100μg/mL 농도로 희석한 7가지 추출물을 처리해 48시간 동안 배양했다. 2차 배양 후 상층 배양액을 제거하고 MTT 용액 5mg/mL를 가해준 뒤 온도 37℃, CO2 농도 5% 의 환경에서 MTT를 결정이 생성되도록 했다. 각 well에 생성된 결정은 DMSO로 녹여 540nm에서의 흡광도를 측정했다.

 

2-8. 멜라닌 생성 측정

 

멜라닌 측정을 위해 먼저 배양된 B16F10을 96 well plate에 well 당 5×104 cell을 주입해 24시간 배양했다. 배양이 끝난 후 100μg/mL를 기준으로 2배 다단희석을 통해 6.25-100μg/mL 농도로 희석한 7가지 추출물과 α-MSH 100nM을 처리해 72시간 동안 배양했다. 배양 후 1N NaOH 0.1μL 처리 후 1시간 동안 방치해 멜라닌을 용해시킨 후 405nm 흡광도를 측정했다.

 

3. 결과 및 고찰


3-1. DPPH 라디컬 소거능

 

7가지 혼합추출물을 31.25-500μg/mL로 희석해 실험을 진행한 결과는 그림1과 같다. EC50을 통해 비교 확인한 결과, ascorbic acid는 17.44μg/mL, 본 추출물은 105.74μg/mL로 나타났다. ascorbic acid가 라디컬 소거능을 100%로 보았을 때 7가지 혼합 추출물이 약 16.50%의 항산화능이 있음을 확인했다. 한편, 본 연구에 사용된 추출물 중 하나인 서양민들레 열수 추출물의 경우 EC50은 176.99μg/mL로 나타나 7가지 혼합추출물의 항산화능이약 1.67배 강한 것으로 확인됐다5). 또 그라비올라 잎 추출물에 대한 연구의 결과를 기반으로 EC50을 계산한 결과, 추출물의 EC50은 875.98μg/mL로 나타나 7가지 혼합 추출물의 항산화능이 약 8.28배 강한 것으로 나타났다6).

 

그림1 DPPH radical rate of 7 complex extracts. ( *p<.05, **p<.01, ***p<.001)

 

 

3-2. ABTS 라디컬 소거능

 

7가지 추출물을 31.25-500μg/mL로 희석해 실험을 진행한 결과는 그림2와 같다. 실험결과를 IC50을 통해 비교 확인한 결과, ascorbic acid는 9.11μg/mL, 본 추출물은 85.31μg/mL로 나타났다. Spiraea prunifolia 뿌리 열수추 출물과 해당 결과를 비교할 경우 Spiraea prunifolia 뿌리 열수추출물의 EC50은 124.0μg/mL로 7가지 혼합추출물의 항산화능이 약 1.45배 강한 것으로 나타났다7).

 

그림2 ABTS radical rate of 7 complex extracts. ( *** p<.001)

 

 

3-3. FRAP&폴리페놀 및 플라보노이드 함량


표1의 결과, 7가지 추출물 1mg의 FRAP은 ascorbic acid 198.01±5.50μg, 폴리페놀은 30.19±0.75μg/mg, 플라보노이드는 9.12±0.36μg/mg으로 나타났다. 결과를 비교할 경우 상황버섯 열수 추출물의 폴리페놀은 16.33μg/mg으로 7가지 혼합추출물의 폴리페놀의 함량이 약 1.8배 높은 것으로 나타났으며, 플라보노이드 함량의 경우 4.50μg/mg으로 7가지 혼합추출물의 플라보노이드의 함량이 약 2.0배 높은 것으로 나타났다8).

 

표1 FRAP and polyphenol, flavonoid concentration of 7 complex extracts

 

 

3-4. 세포 독성


세포 독성을 알아본 결과는 표2와 같다. 100μg/mL 농도에서 90.06±2.83%, 50μg/mL 농도에서 92.32± 0.88%, 25μg/mL 농도에서 94.00±1.08%, 12.5μg/mL 농도에서 97.16±0.63%, 6.25μg/mL 농도에서 99.23±1.64%의 세포 생존률이 나타나 ISO 10993-5와 식품의약품안전처 고시 제2014-115호의 기준에 따라 모든 실험 농도에서 세포독성이 나타나지 않은 것으로 확인됐다.

 

표2 Cytotoxicity of 7 complex extracts on B16F10

 

 

3-5. 미백 활성


7가지 혼합추출물이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 평가한 결과는 표3과 같으며, 비교를 위해 arbutin 100μg/ mL 농도에서 진행한 실험에서는 30.69±4.34%의 효과를 확인할 수 있었다. 상황버섯 추출물과 미백활성을 비교할 경우 열수 추출물에서 양쪽 최대 30% 이상의 미백 효과를 내었다.

 

그러나 저농도 조건인 25μg/mL에서의 결과를 비교했을 때, 상황버섯의 경우 21.46%의 미백효과를 보인 데 비해 7가지 추출물의 경우 32.73%의 미백효과를 보여 약 1.5배 더 높은 미백효과를 확인할 수 있었다8).

 

또한 개별 추출물에 대한 실험 결과 중 가장 높은 황금 열수 추출물의 경우 100μg/mL 농도에서 28.31± 1.57%의 미백효과가 나타났으며 이는 선행연구에서 농도에 따라 최대 29%의 멜라닌 생성 억제효과를 보인 것과 유사하다9).

 

한편, 본 혼합 추출물은 황금 열수 추출물에 비해 약 6.39% 높은 효과가 나타났으며 혼합 추출물의 경우 황금 추출물의 비율이 낮음에도 황금추출물보다 높은 효과를 보여 상승효과가 나타난 것으로 생각된다.

 

표3 Melanin production rate of 7 complex extracts on B16F10

 

 

4. 결론


본 연구결과 DPPH 실험에서는 105.74mg ascorbic acid/g의 항산화능을 나타냈으며 ABTS 실험에서는 85.31mg ascorbic acid/g의 항산화능을 나타냈다. FRAP 에서는 7종 혼합추출물의 1mg이 ascorbic acid 198.01±5.50μg의 환원력을 보였다. 폴리페놀 함량은 30.19±0.75mg/g으로 나타났으며 플라보노이드 함량은 9.12±0.36mg/g으로 나타났다.

 

세포독성의 경우 연구에 사용된 농도 범위에서 80% 이상의 세포 생존율을 보였으며 본 추출물이 세포독성이 없음을 확인했다. 또 100μg/mL 농도에서 34.70± 2.97%의 멜라닌 생성 억제능을 보여 7종 혼합추출물의 비건 화장품 원료로서의 가능성을 확인할 수 있었다.

 

문의처
meeth

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